汶川縣水磨鎮綠茶中花青素提取工藝優化

廖輝 劉林 戴先芝 趙文慧

摘 要 花青素具有很強的生物活性，可廣泛用于食品、飲料、醫藥、化工和紡織等行業。花青素提取大多采用有機溶劑提取方法，輔以超聲、微波、加壓或者酶解等可以提高花青素的提取率。采用超聲水浴輔助提取，紫外分光光度法測定水磨鎮農產品綠茶中花青素的含量。正交試驗優化提取條件，篩選出最佳的提取條件，即70%乙醇提取溶劑，料液比為1∶45，提取溫度70 ℃，提取時間70 min，從水磨鎮綠茶中提取到花青素含量0.460 3 mg·g-1。

關鍵詞 綠茶;花青素含量;紫外分光光度法;超聲提取;汶川縣水磨鎮

中圖分類號：TS272;TS201.2 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.07.023

汶川縣產茶歷史悠久，距今已有一千多年的歷史。水磨鎮是汶川縣南部的一個重要茶葉產地，2014年5月成立水磨鎮二村溝茶葉種植專業合作社，其茶園種植面積達200多hm2。水磨鎮位于北緯30°～31°、東經102°～103°，海拔1 000 m，屬亞熱帶山區，河流廣闊，降雨量豐富，氣候宜人，空氣濕度相對較大，利于茶葉生長[1-2]。

近年來，茶葉花青素成為研究熱點[3-5]。茶葉花青素具有很強的生物活性，可廣泛用于食品、飲料、醫藥、化工和紡織等行業。前人研究表明，茶樹芽葉顏色與花青素含量呈明顯的正相關。花青素含量與茶樹生長環境關系密切，光照強有利于花青素的累積，強紫外光條件下，茶樹體內新陳代謝也會促進花青素的形成[4]。花青素是重要的生物活性補充劑，紅茶加工會導致茶葉花青素含量顯著減少，綠茶加工對茶葉花青素含量的影響不大[6]。

花青素提取大多采用有機溶劑提取方法，輔以超聲、微波、加壓或者酶解等可以提高花青素的提取率。徐燁等[7]采用微波與超聲處理花青素-多酚液態和固態模擬體系，闡釋微波與超聲處理對花青素-多酚相互作用呈色的影響機制。魏心源等[8]綜述了乙醇浸提法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法提取黑豆中花青素的研究進展。張東方等[9]以茄子果實作試驗材料，利用光譜儀掃描果皮獲取其光譜反射率，使用pH示差法測量花青素含量。黃武等[10]在超聲輔助提取的基礎上，結合水浴浸提探究花生紅衣中原花青素的提取方法，用正交試驗對工藝進行優化。呂品等[11]利用香草醛法測定莽吉柿果殼原花青素的含量，借助響應面法分析顯色條件，發現采用硫酸作為酸化介質，體系的穩定性較強;對測定影響最大的因素是硫酸濃度，其次是香草醛濃度，影響最小的是反應溫度。

目前相關研究中大多是以酸性極性溶劑作為提取劑。國外學者Deineka等[12]把從東方紫荊葉中提取的物質，動態固相純化后，在Agilent1200上分離出花青素，考查酸/磷酸-水體系、乙腈和酸濃度對花青素色譜行為的影響。Huang等[13]利用超高效液相色譜-串聯質譜法提取紅豆杉果實花青素，結果在“大紅1號”果皮中鑒定出17種花青素，發現果實顏色變異與某幾種花青素含量相關。Li等[14]用50% AcOH-MeOH提取劑從“香港紅山茶”的山茶科植物中提取鑒定了12種花青素。王秋霜等[15]以80%乙醇、0.6%鹽酸為提取劑，利用超聲輔助從紅紫芽茶葉中提取分離到的花青素含量達3.782 5 mg·g-1;劉長姣等[16]以0.8%鹽酸-50%乙醇水溶液作提取劑，通過水浴振蕩從黑米提取到的花青素含量為1.249 mg·g-1;李紹波等[17]用0.5%硫酸乙醇作提取劑，從紫甘薯中提取出3.671 6 mg·g-1的花青素。花青素含量測定常用pH示差法、紫外分光光度法、高效液相色譜法。目前，水磨綠茶茶葉的花青素相關研究還未見報道。本試驗采用傳統的有機溶劑提取并以超聲水浴作為輔助，設計了4個單因素試驗，并結合正交試驗探討水磨綠茶中花青素的最佳提取條件，通過紫外分光光度計測定出花青素含量。

通過溶劑極性減少其他雜質的浸出，并以1%鹽酸維持提取劑的酸性以保證花青素的穩定性，同時使茶葉中的原花青素、花白素二者部分轉化成花青素，通過溶劑萃取法再次分離出提取液中的花青素，采用乙酸乙酯萃取出提取液中的咖啡堿、兒茶素等[18-19]，最終測得茶葉中的總花青素含量。已有的試驗結果表明，使用甲醇提取能在提取過程中很大程度上減小除花青素以外的極性雜質浸出對花青素純度的影響[5]，但甲醇的毒性大且揮發性強，秉著綠色生態理念，選擇乙醇作提取劑更好。此外，利用單純的有機溶劑進行提取的效果并不好，因為其滲透性較差，加入一定比例的蒸餾水作傳質[5]反而起了很好的效果，因而在本試驗中選擇酸性乙醇水溶液作提取溶劑。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

樣品：選取水磨鎮大二溝村4月的綠茶茶葉（一芽二葉，烘干），粉碎，備用。

藥品：花青素（標準品）、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（CAS：7084-24-4，BZP0428）、鹽酸（AR）、無水乙醇（AR），均購自四川西隴科學有限公司;乙酸乙酯（AR），購自成都市科隆化學品有限公司。

儀器設備：UV-1800PC紫外可見分光光度計;JJ324BC型電子天平;PS-100A超聲清洗儀;880Y高速多功能粉碎機;蜀牛GG-17抽濾瓶;SHB-Ⅲ循壞水式多用真空泵;TDZ6B-WS臺式低速自動平衡離心機。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?確定最大吸收波長

準確稱量0.005 0 g矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（標準品），用無水乙醇、1%鹽酸、蒸餾水體積比為2∶1∶1的溶劑進行溶解，并將其轉移至50 mL容量瓶中，定容，配制成0.10 mg·mL-1標準溶液。在準確移取1.5 mL標準溶液于25 mL容量瓶中，定容。在240～700 nm波長范圍內進行紫外-可見分光光度計光譜掃描，確定最大吸收波長。

1.2.2 ?繪制標準曲線

分別準確移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL的標準溶液于25 mL容量瓶中，加入無水乙醇、1%鹽酸、蒸餾水體積比為2∶1∶1的溶劑定容，即得到6個濃度的系列標準溶液。在步驟1.2.1所確定的最大吸收波長處測定，繪制出標準曲線，并得到線性回歸方程。

1.2.3 ?單因素試驗

乙醇濃度的選擇：準確稱量7份1.2 g綠茶樣品于250 mL錐形瓶中，分別加入濃度為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的30 mL乙醇溶液，15 mL 1%鹽酸，15 mL蒸餾水，超聲水浴溫度60 ℃，提取時間25 min。抽濾、放置冷卻，乙酸乙酯萃取。以5 000 r·min-1的轉速離心10 min，測定并記錄各澄清液的吸光度值。

料液比的選擇：準確稱量6份1.2 g綠茶樣品于250 mL錐形瓶中，各加入料液比為1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50的60%乙醇溶液、1%鹽酸與蒸餾水，三者的用量按照60%乙醇、1%鹽酸、蒸餾水體積比2∶1∶1確定，超聲水浴溫度60 ℃，提取25 min。抽濾、放置冷卻，乙酸乙酯萃取。以5 000 r·min-1的轉速離心10 min，測定并記錄各澄清液的吸光度值。

提取溫度的選擇：準確稱量6份1.2 g綠茶樣品于250 mL錐形瓶中，各加入料液比為1∶40的60%乙醇溶液、1%鹽酸和蒸餾水，三者的用量按照60%乙醇、1%鹽酸、蒸餾水體積比2∶1∶1確定，超聲水浴溫度分別設定為30、40、50、60、70、80 ℃，提取25 min。抽濾、放置冷卻，乙酸乙酯萃取。以5 000 r·min-1的轉速離心10 min，測定并記錄各澄清液的吸光度值。

提取時間的選擇：準確稱量6份1.2 g綠茶樣品于250 mL錐形瓶中，各加入料液比為1∶40的60%乙醇溶液、1%鹽酸和蒸餾水，三者的用量按照60%乙醇、1%鹽酸、蒸餾水體積比2∶1∶1確定，超聲水浴溫度60 ℃，提取時間分別設定為10、20、30、40、50、60 min。抽濾、放置冷卻，乙酸乙酯萃取。以5 000 r·min-1的轉速離心10 min，測定并記錄各澄清液的吸光度值。

1.2.4 ?正交試驗

以乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間等4因素，設計正交試驗，優化綠茶花青素提取條件。

2 ?結果與分析

2.1 ?標準曲線繪制

同1.2.1的操作方法，在240～700 nm波長掃描，確定其最大特征吸收波長為531 nm，并繪制矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的標準曲線。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷濃度范圍為0.000～0.024 mg·mL-1，得到其線性回歸方程：C=0.019 8×A+0，相關系數R=0.999 9，如圖1所示。

花青素含量=CV/m ?（1）

式（1）中，C為回歸方程下的花青素濃度，g·L-1;V為提取劑體積，L;m為綠茶樣品質量，kg。

2.2 ?單因素試驗結果

單因素試驗結果表明，選擇70%乙醇濃度（見圖2），料液比1∶45（見圖3），超聲水浴溫度為70 ℃（見圖4），超聲提取時間60 min（見圖5），花青素提取率高。

2.3 ?正交試驗結果

根據單因素試驗結果，選取4因素3水平，設計正交試驗（見表1）。

由表2可知，影響綠茶中花青素提取含量的因素排序為：料液比>乙醇濃度>提取溫度>提取時間。提取條件：乙醇濃度70%，料液比1∶45，溫度70 ℃，時間60 min。平行測定三個樣，相對平均偏差為1.1%，測定出綠茶中花青素含量為0.460 3 mg·g-1。

3 ?討論

采用超聲水浴輔助-有機溶劑浸取的方式提取綠茶中的花青素，紫外分光光度計測定其含量。篩選出較優的提取條件為乙醇濃度70%，料液比1∶45，溫度70 ℃，時間60 min，提取到水磨綠茶中花青素含量為0.460 3 mg·g-1。與紅紫芽葉茶相比，水磨當地種植的綠茶中花青素含量偏低。要發展水磨綠茶產業，可從改良水磨當地綠茶的品種著手，有研究證明芽葉顏色深淺與花青素含量有著密切關系，開發種植茶樹新品種，使其具有高含量的花青素，有利于水磨茶葉品質改良。

茶產業帶來的效益推動了當地經濟的發展，除了通過打造茶旅融合、對外銷售的方式來促進茶產業發展外，還可以開發茶葉深加工產品，發掘茶葉更大的價值，助推當地經濟發展。

參考文獻：

[1] ? 李懿，余列.汶川縣水磨三江地區百合屬花卉種質資源及其生境類型[J].農業科技通訊，2017（3）： 272-275.

[2] ? 張海峰.汶川縣茶葉產業發展的SWOT分析[J].福建茶葉， 2018， 40（4）： 63.

[3] ? 龐丹丹，張芬，張亞真，等.茶葉花青素合成、調控及功能的研究進展[J].茶葉科學，2018，38（6）：606-614

[4] ? 謝曉娜，楊鄭州，王建暉，等.紫芽葉茶花青素研究進展[J].食品研究與開發，2021，42（11）：204-211.

[5] ? 劉林峰，向奕，劉安，等.茶葉花青素的研究進展[J].茶葉通訊，2018，45（1）：3-8.

[6] ? Hu Jian-Guang， Zhang Long-Jie， Sheng Yue-Yue， et al. Screening tea hybrid with abundant anthocyanins and investigating the effect of tea processing on foliar anthocyanins in tea[J]. Folia Hort， 2020， 32（2）： 279-290.

[7] ? 徐燁，李旋，畢金峰，等.微波與超聲處理對花青素-多酚固態與液態體系色澤的影響[J].食品科學，2021，42（1）：139-148.

[8] ? 魏心源，陳虹印，程道梅.黑豆種皮花青素生理功能、分離純化及應用研究進展[J].食品與機械，2021，37（3）： 221-227.

[9] ? 張東方，張君，范曉飛，等.應用光譜分析無損測定茄子果皮花青素含量方法[J].河北農業大學學報，2021，44（3）： 62-67.

[10] 黃武，李亞杰，亢帥，等.超聲輔助提取花生紅衣中原花青素[J].食品研究與開發，2021，42（10）： 112-117.

[11] 呂品，桑田，李朋偉，等.響應面法優化香草醛法測定莽吉柿果殼原花青素[J].食品研究與開發，2021，42（2）：160-165.

[12] Deineka V I， Oleinits E Y， Kulchenko Y Y， et al. Chromatographic separation and determination of anthocyanins under conditions of reversed phase chromatography， when used as mobile phases of Acetonitrile-Formic Acid/Phosphoric Acid-Water Systems[J]. Russian Journal of Physical Chemistry A， 2021， 95（8）： 1278-1283.

[13] Huang Ding， Ming Ruhong， Yao Shaochang， et al. Identification of anthocyanins in the fruits of Kadsura coccinea using UPLC-MS/MS-based metabolomics[J]. Biochemical Systematics and Ecology， 2021， 98： 1-5.

[14] Li Jian-bin， Hashimoto F， Shimizu K， et al. A new acylated anthocyanin from the red flowers of Camellia hongkongensis and characterization of anthocyanins in the section Camellia species[J]. Journal of integrative plant biology， 2009， 51（6）： 545-552.

[15] 王秋霜，凌彩金，劉淑媚，等.紅紫芽茶葉花青素提取分離及pH穩定性初探[J].中國農學通報，2014，30（9）：291-296.

[16] 劉長姣，鄭霞，熊湘煒，等.分光光度法測定黑米花青素方法的建立[J].糧食與油脂，2019，32（1）：73-77.

[17] 唐偲琦，李紹波，郎春輝，等.紫甘薯中花青素類色素提取和分光光度法測定[J].現代預防醫學， 2013， 40（9）：1721-1723.

[18] 王帥.紫娟茶中花青素提取方法及花青素生物學作用的研究[D].泰安：山東農業大學，2011.

[19] 王日為，張麗霞，高吉剛.茶葉中花青素類物質研究展望[J].茶葉科學技術，2002（4）：4-8.

（責任編輯：易 ?婧）