FOXO3A誘導(dǎo)結(jié)腸癌西妥昔單抗耐藥的發(fā)生

黃志鵬 安娜 游必凱 付達華

摘 ?要：目的 ?分析轉(zhuǎn)錄因子FOXO3A在消化道腫瘤中的表達，并分析其在西妥昔單抗耐藥中的作用。方法 ?通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析FOXO3A在消化道腫瘤中的表達水平及其與疾病無進展生存期和總體生存期的關(guān)系。通過對臨床西妥昔治療患者的術(shù)后樣本進行FOXO3A免疫組織化學(xué)染色，分析其表達水平與西妥昔治療效果的關(guān)系。通過構(gòu)建西妥昔耐藥Caco2細胞系（Caco2-CR），分析FOXO3A表達水平。通過在Caco2-CR細胞系中敲減FOXO3A，在Caco2西妥昔敏感細胞系（Caco2-CS）中上調(diào)FOXO3A表達，CCK-8（Cell Counting Kit-8）分析其增殖能力及對西妥昔治療的反應(yīng)性。結(jié)果 ?FOXO3A在食管癌、胃癌及直腸癌中表達高于其對應(yīng)癌旁組織，在胃癌患者中，高表達FOXO3A患者的總體生存（P=0.044）及疾病無進展生存（P=0.015）較低表達FOXO3A患者差。在西妥昔耐藥的結(jié)腸癌患者中，腫瘤組織中FOXO3A表達水平較高;而在西妥昔敏感患者中，腫瘤組織FOXO3A表達水平呈中等-低水平。西妥昔單抗不能有效抑制過表達FOXO3A的Caco2-CS細胞系;但在敲減FOXO3A的Caco2-CR細胞中，西妥昔單抗能有效抑制細胞增殖。結(jié)論 ?FOXO3A作為轉(zhuǎn)錄因子，在結(jié)腸癌患者西妥昔單抗耐藥中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：FOXO3A;西妥昔單抗;消化道腫瘤

中圖分類號：R735文獻標識碼：A文章編號：1009-8011（2022）-10-0-05

消化道腫瘤是常見的癌癥，其中結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）為全球第三大常見的癌癥。目前，只有少數(shù)的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸患者可以治愈;對于其他患者，化療可改善癥狀，同時延長生存期。在大部分患者中，隨著治療時間的延長，腫瘤耐藥性也隨之出現(xiàn)。西妥昔單抗屬于靶向治療，其本身是一種嵌合單克隆抗體，對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）具有高度選擇性，可與EGFR胞外段結(jié)合，阻斷下游的信號通路，抑制腫瘤細胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)[1]，在25%～80%的結(jié)直腸癌中存在EGFR過表達，且與疾病進展相關(guān)，用于治療RAS基因野生型轉(zhuǎn)移性CRC。然而腫瘤細胞對西妥昔單抗的耐藥限制了其臨床使用及藥物的有效性。

叉頭框O（fork head box class O，F(xiàn)OXO）家族是一種廣泛表達的轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)OXO3A是其核心成員，在人體多個器官均有表達，包括胃、腸、肺、乳腺、卵巢、前列腺和白細胞等，其活性受到多個水平的調(diào)節(jié)，包括基因表達水平、翻譯后水平、蛋白穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)相互作用等多個層面[2]。FOXO3A作為中央轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)多種生理和病理過程，參與細胞凋亡、細胞增殖、細胞周期、生存和DNA損傷。FOXO3A通過直接誘導(dǎo)或間接激活與細胞增殖、生長和存活相關(guān)基因的表達，調(diào)節(jié)腫瘤多種病理生理過程，其信號傳導(dǎo)調(diào)控異常可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。既往研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中FOXO3A表達上調(diào)，且與腫瘤分化程度、浸潤深度、遠處轉(zhuǎn)移、分期和組織學(xué)分類相關(guān)[3]。然而，F(xiàn)OXO3A在消化道腫瘤中與抗腫瘤藥物治療的關(guān)系，特別是在單抗藥物治療中的作用尚不清楚。

1 ?材料與方法

1.1 ?TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析

在數(shù)據(jù)庫中分析消化道腫瘤中，包括食管癌、胃癌、結(jié)腸癌及直腸癌，腫瘤組織與癌旁組織中FOXO3A的表達水平;同時，比較在不同腫瘤分期中的表達差異;分析不同F(xiàn)OXO3A表達水平與患者疾病無進展生存期及總體生存的關(guān)系。利用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Logrank秩檢驗分析生存差異。

1.2 ?西妥昔耐藥細胞系的建立

Caco2細胞系購自中國科學(xué)院細胞庫，且通過DNA分析測試。Caco2細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件37℃、5% CO2。在6個月的時間里，使Caco2細胞持續(xù)暴露于濃度不斷增加的西妥昔單抗（生產(chǎn)企業(yè)：Merck Healthcare KGaA，注冊證號S20171039）中，起始劑量10 μg/mL，2個月后增加至50 μg/mL，再經(jīng)過2個月后增加至200 μg/mL，最后，將建立的西妥昔單抗耐藥的Caco2細胞株（Caco2-cetuximab-resistance，Caco2-CR）保持在連續(xù)培養(yǎng)中，使用200 μg/mL的西妥昔單抗條件下維持細胞增殖。未經(jīng)西妥昔單抗處理的Caco2細胞為西妥昔單抗敏感細胞系（Caco2-CS）。

1.3 ?CCK-8檢測細胞增殖

利用Cell Counting Kit-8檢測西妥昔單抗及對照組培養(yǎng)基連續(xù)處理西妥昔單抗敏感細胞系和西妥昔單抗耐藥細胞系4 d的細胞增殖水平;檢測過表達FOXO3A的西妥昔單抗敏感細胞系及敲減FOXO3A的Caco2-CR細胞系經(jīng)西妥昔單抗及對照培養(yǎng)基連續(xù)處理4 d的細胞增殖水平。具體操作如下所述：將細胞按每孔2000細胞/100 μL鋪入96孔板中，每孔加入300 μg/mL的細胞培養(yǎng)液，連續(xù)檢測4 d。檢測前，在培養(yǎng)基中加入10 μL CCK8終止培養(yǎng)。2 h后，使用酶標儀測定酶標板，利用OD450值測定細胞增殖水平，按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 ?免疫組織化學(xué)染色

對臨床接受西妥昔單抗化療的15例術(shù)前結(jié)腸癌樣本進行FOXO3A免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片經(jīng)過二甲苯（10 min，2次）、無水乙醇（10 min）、95%乙醇（10 min）、85%乙醇（10 min）、75%乙醇（10 min）后，利用EDTA緩沖液（pH 9.0）高壓2 min進行抗原修復(fù)，然后自然冷卻至室溫，利用1×PBT緩沖液洗3遍后，切片在0.3%的過氧化氫中孵育30 min以滅活內(nèi)源性過氧化物。然后利用正常山羊血清工作液封閉1 h，采用抗FOXO3A單克隆抗體（1：100稀釋，生產(chǎn)企業(yè)：美國Cell Signaling Technology）作為一抗，在4℃下孵育過夜;利用1×PBT緩沖液洗3遍后，用高度敏感的鏈親和素-生物素-過氧化物酶檢測系統(tǒng)進行染色;利用1×PBT緩沖液洗3遍后，用蘇木素進行細胞核染色。顯微鏡下觀察染色情況。

1.5 ?WB檢測蛋白表達

收集各處理組的細胞樣本，加入全蛋白酶抑制劑及RIPA裂解液提取細胞蛋白，4℃充分裂解細胞15～20 min后，4℃離心15 min，收集上清液后利用BSA蛋白定量試劑盒進行總蛋白定量，按試劑盒說明書進行操作。定量后，在蛋白上清液中加入5×loading buffer，搖勻，100℃水浴變性10 min后將蛋白保存于-20℃冰箱。將20 μg總蛋白進行SDS-PAGE分析，采用10%分離膠進行蛋白電泳;使用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，利用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后加入一抗，F(xiàn)OXO3A單克隆抗體（CST）4℃孵育過夜。利用1×TBST緩沖液洗膜3遍后，加入辣根酶標記山羊抗兔IgG（1：5000稀釋，生產(chǎn)企業(yè)：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），室溫孵育1 h。利用化學(xué)發(fā)光試劑顯影（ECL）。

1.6 ?細胞轉(zhuǎn)染

構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白序列的人FoxO3A-shRNA慢病毒載體（吉凱基因），重組FoxO3A慢病毒和陰性對照慢病毒的轉(zhuǎn)染滴度為109 TU/mL。將西妥昔單抗耐藥細胞按每孔2×105細胞接種于6孔板中，第2 d加入8 μg/mL polybrene及病毒。轉(zhuǎn)染72 h后，用含4 μg/mL嘌呤霉素的選擇培養(yǎng)基替換DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d后，更換為2 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基，擴增7 d后轉(zhuǎn)移至正常培養(yǎng)基中。過表達細胞系的構(gòu)建流程：將FOXO3A ORF克隆至慢病毒載體GV358中（吉凱基因），利用包裝質(zhì)粒pHelper 1.0及2.0生成表達FOXO3A的慢病毒并感染西妥昔單抗敏感細胞系。轉(zhuǎn)染72 h后，在含1 μg/mL嘌呤霉素的DMEM中培養(yǎng)篩選出穩(wěn)定表達FOXO3A的細胞。

1.7 ?統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，應(yīng)用ANOVA法分析FOXO3A在腫瘤組織及癌旁組織的表達差異，及FOXO3A在不同腫瘤分期中的表達差異，使用GarphPad Prism 7軟件繪圖。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 ?FOXO3A在消化道腫瘤的表達及與預(yù)后的關(guān)系

通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3A在食管癌、胃癌及直腸癌中表達高于其對應(yīng)癌旁組織，而在結(jié)腸癌中FOXO3A在腫瘤及癌旁組織中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖1A。根據(jù)腫瘤分期進一步分析發(fā)現(xiàn)，在食管癌、胃癌及結(jié)直腸癌臨床分期中，F(xiàn)OXO3A轉(zhuǎn)錄水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖1B。在胃癌患者中，高表達FOXO3A患者的OS（P=0.044）及DFS（P=0.015）較低表達FOXO3A患者差;而在食管癌、結(jié)腸癌及直腸癌中未發(fā)現(xiàn)FOXO3A的表達與預(yù)后的關(guān)系，見圖2。

2.2 ?FOXO3A在西妥昔單抗耐藥細胞系中的表達

通過分析15例西妥昔單抗治療的結(jié)腸癌患者（KRAS/NRAS野生型）術(shù)前切片F(xiàn)OXO3A的表達，6/15患者為西妥昔單抗耐藥，9/15患者為西妥昔單抗敏感。在6例西妥昔單抗耐藥的患者中，5例患者FOXO3A表達水平較高;而9例西妥昔單抗敏感患者中，6例患者FOXO3A表達水平低，3例患者表達水平中等，見圖3A。

在西妥昔單抗敏感的細胞系中，加入西妥昔單抗處理后可顯著抑制細胞增殖（P<0.001）;與西妥昔單抗敏感細胞系相比，Caco-2-CR細胞的增殖速度在第4 d明顯更低（P<0.05）;西妥昔單抗不會影響西妥昔單抗耐藥細胞的增殖，見圖3B。

西妥昔單抗耐藥細胞系中FOXO3A的蛋白表達水平高于西妥昔單抗敏感細胞系，見圖3C。通過慢病毒成功構(gòu)建過表達FOXO3A的西妥昔單抗敏感細胞系和敲減FOXO3A的西妥昔單抗耐藥細胞系，見圖3C。過表達FOXO3A的西妥昔單抗敏感細胞系的增殖速度較對照組細胞明顯更快（P<0.01），見圖3D;加入西妥昔單抗處理后，過表達FOXO3A的西妥昔單抗敏感細胞系的增殖速度顯著快于對照組細胞系（P<0.001），見圖3D。敲減FOXO3A的西妥昔單抗耐藥細胞系，其增殖速度明顯慢于對照組（P<0.01），見圖3D;西妥昔單抗能夠顯著抑制FOXO3A的西妥昔單抗耐藥細胞增殖（P<0.001），見圖3D。

3 ?討論

本研究結(jié)果顯示，在西妥昔耐藥的結(jié)腸癌患者中，F(xiàn)OXO3A表達水平上調(diào)。FOXO3A的高表達可能是西妥昔單抗在結(jié)腸癌患者治療中療效的預(yù)測生物標志物。FOXO3A是中央轉(zhuǎn)錄因子，相對分子質(zhì)量約為71Kd，包含5個結(jié)構(gòu)域，具有多種功能：①通過誘導(dǎo)多種靶基因轉(zhuǎn)錄（包括細胞凋亡、細胞周期和DNA損傷修復(fù)）調(diào)節(jié)多個生理和病理過程;②與人類壽命密切相關(guān);③參與調(diào)節(jié)肌肉和癌細胞的自噬過程。本研究表明，F(xiàn)OXO3A的表達和/或活性的失調(diào)與一系列惡性腫瘤高度相關(guān)，如乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、膀胱癌等。FOXO3A最近已成為診斷、預(yù)后和治療多發(fā)性惡性腫瘤的潛在生物標志物，其表達已被確定為霍奇金淋巴瘤的癌細胞生物標志物。FOXO3A的表達水平與預(yù)后相關(guān)，其過表達與三陰性乳腺癌、肝癌、膠質(zhì)母細胞瘤和胃癌患者的預(yù)后相關(guān)，而其低表達在膠質(zhì)瘤和卵巢癌患者中與不良預(yù)后相關(guān)。磷酸化FOXO3A的表達在卵巢癌和急性髓系白血病中也被確定為預(yù)后生物標志物。FOXO3A的核定位被證明是一種乳腺癌的預(yù)后標志物。此外，F(xiàn)OXO3A的亞細胞定位被確定為預(yù)測宮頸癌、乳腺癌和食道癌化療和放療反應(yīng)的生物標志物。

盡管西妥昔單抗和化療對大部分轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸患者有很好的療效，但在臨床中對西妥昔單抗治療產(chǎn)生應(yīng)答的持續(xù)時間僅為8～10個月，主要原因為西妥昔單抗耐藥的出現(xiàn)。西妥昔耐藥受多種因素的調(diào)控[4-6]。內(nèi)源性機制包括表皮生長因子受體配體過表達、表皮生長因子受體突變、RAS/RAF/PI3K基因突變、ERBB2/MET/IGF-1R激活、代謝重塑、微衛(wèi)星不穩(wěn)定及自噬增強等。外源性機制主要是腫瘤微環(huán)境的可塑性，特別是免疫細胞、腫瘤相關(guān)成纖維細胞和血管生成等，使得腫瘤對西妥昔單抗出現(xiàn)耐藥。PI3K-Akt是表皮生長因子受體下游的經(jīng)典信號通路，是參與腫瘤細胞增殖的關(guān)鍵細胞表面受體。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3A通路對膠質(zhì)瘤細胞的放療耐藥至關(guān)重要，抑制其表達可增強對患者的放療應(yīng)答。在乳腺癌中，拉帕替尼可通過誘導(dǎo)FOXO3A轉(zhuǎn)錄因子表達，進而上調(diào)c-Myc的表達，使其與表觀遺傳調(diào)控因子合作，抑制乳腺癌細胞對拉帕替尼的敏感性。在肺癌中，SIRT3/FOXO3A影響肺癌細胞對放療的敏感性。這些發(fā)現(xiàn)表明FOXO3A可能是產(chǎn)生耐藥性的一個潛在因素，高表達的FOXO3A及p38 MAPK可以預(yù)測KRAS野生型結(jié)直腸癌患者對西妥昔單抗的治療反應(yīng)[7-8]。長期使用西妥昔單抗處理的細胞系中FOXO3A的表達水平上調(diào)，其可進一步通過誘導(dǎo)c-Myc轉(zhuǎn)錄促進丙酮酸激酶肌肉同工酶M2的表達上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，同時下調(diào)FOXO3A和c-Myc能夠顯著抑制腫瘤的增殖[9-10]。c-Myc是腫瘤發(fā)生發(fā)展中調(diào)控細胞存活、代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子。有研究發(fā)現(xiàn)[11]，F(xiàn)OXO3A與c-Myc有關(guān)，可促進缺氧代謝適應(yīng)。因此，F(xiàn)OXO3A是結(jié)直腸癌對西妥昔耐藥的關(guān)鍵調(diào)控因子。此外，F(xiàn)OXO3A使得樹突狀細胞對腫瘤抗原特異性CD8+T細胞耐受，提示其可能與腫瘤免疫微環(huán)境相關(guān)。綜上，F(xiàn)OXO3A在西妥昔單抗耐藥中發(fā)揮重要作用，其確切機制還需要進一步深入研究。

參考文獻

[1]Marzi L， Combes E， Vie N， et al. FOXO3a and the MAPK p38 are activated by cetuximab to induce cell death and inhibit cell proliferation and their expression predicts cetuximab efficacy in colorectal cancer[J]. Br J Cancer，2016，115（10）：1223-33.

[2]鐘振，劉益飛，劉俊華.FOXO3a基因在癌癥中的研究進展[J].中國腫瘤外科雜志，2013，5（3）：184-186.

[3]劉鑫，胡皆樂，李佑，等.FOXO3在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義[J].實用癌癥雜志，2016，31（11）：1773-1777.

[4]胡珊珊，宋彥，羅玉明，等.MiR-150-5p靶向HIF1α調(diào)控結(jié)直腸癌細胞西妥昔單抗耐藥的相關(guān)機制研究[J].四川醫(yī)學(xué)，2020，41（7）：688-691.

[5]蘇昊，劉文杰，包滿都拉，等.轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌西妥昔單抗耐藥的分子機制[J].國際腫瘤學(xué)雜志，2020，47（5）：308-311.

[6]吳軍，計駿，張俊，等.結(jié)腸癌K-ras突變與對西妥昔單抗耐藥的實驗研究[J].外科理論與實踐，2009，14（4）：396-402.

[7]Zhou J， Ji Q， Li Q. Resistance to anti-EGFR therapies in metastatic colorectal cancer： underlying mechanisms and reversal strategies[J]. J Exp Clin Cancer Res，2021，40（1）：328.

[8]方慶亮，董昌盛，陳榮，等.SIRT3/FOXO3通路在肺癌A549細胞放療抵抗中的作用機制研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2021，31（12）：28-34.

[9]滕春媛，李梅，范清玲.常規(guī)化療方案聯(lián)合西妥昔單抗治療消化道腫瘤的效果分析[J].醫(yī)藥前沿，2021，11（27）：90-91.

[10]熊峰，陶敏，段衛(wèi)明，等.西妥昔單抗聯(lián)合伊立替康三線治療晚期結(jié)直腸癌的療效觀察[J].中華腫瘤防治雜志，2008，15（22）：1759-1760.

[11]Ferber E C， Peck B， Delpuech O， et al. FOXO3a regulates reactive oxygen metabolism by inhibiting mitochondrial gene expression[J]. Cell Death Differ 2012，19（6）：968-979.