微電解無菌水系統在實驗動物屏障設施中應用的跟蹤監測

張 薇, 唐 彬, 趙 勇, 張志妮, 鄧新燕

(中山大學實驗動物中心,廣州 510006)

目前，國內實驗動物屏障設施中無菌水的相關報告很少。實驗動物屏障設施的無菌水系統猶如人體的血液循環系統，不僅供給動物不可或缺的飲用水，也為屏障內的日常清潔等工作提供用水，是影響動物質量和干擾實驗研究的潛在因素。根據國家標準《實驗動物環境與設施》GB 14925—2010 要求，清潔級以上的實驗動物飲用水應達到無菌要求；而對于清潔級以上屏障設施中日常工作用水則沒有明確規定，但要求屏障環境中的沉降菌最大平均濃度［每0.5 h內φ90 mm 平皿中菌落形成單位（colony-forming unit，CFU）］≤3。屏障環境用水一旦污染也將導致動物生存環境污染，因此，屏障設施內的日常工作用水也應達到無菌要求。有些屏障設施中無菌水系統制水不能持續保持無菌，遂采用高壓滅菌器滅菌制備動物飲用水，而屏障設施內日常工作用水則采用添加化學消毒劑的方法制備。但是能達到滅菌效果的化學消毒劑較少，且化學消毒或滅菌劑效果受影響的因素較多，如物體表面有機物、塵埃、水的酸堿性及水中有機物等均會降低滅菌效果。因此，屏障環境工作用水同樣需要控制微生物而達到無菌，才能消除屏障環境與動物污染隱患。

中山大學實驗動物中心于2008年開始將微電解無菌水系統應用到屏障設施中供應SPF 級動物飲用水和日常工作用水，并于2018 年11 月新增微電解儀備用機。前期研究表明，微電解無菌水可以持續保持無菌，并對SD大鼠的血液生化等臨床指標沒有影響［1］。2018年4月～2022年3月本中心對微電解無菌水系統的使用情況進行了跟蹤觀察，然后對微電解無菌水系統配置、運行管理中的細節加以總結和分析，以供同行借鑒。

1 材料與方法

1.1 微電解無菌水系統

微電解無菌水系統由超濾、微電解儀、循環輸水管路和屏障實設施內終端供水口組成。微電解儀1 號和2 號互為備用，當其中一臺發生故障時，啟用另外一臺。微電解用220 V 電源，實際工作電壓≤80 V，功率為280 W；微電解儀產生的電流為2 A～10 A。超濾材料主要有5 μm保安過濾膜、1 μm精密過濾膜、0.1 μm超濾膜。微電解無菌水系統由廣州惜水科技有限公司提供。系統工藝流程見圖1 所示，虛線左側為屏障環境設施內管網布局，右側為屏障環境設施外管網及機房布局。

圖1 微電解無菌水系統的工藝流程簡圖Figure 1 Process flow diagram of micro-electrolyzed sterile water system

1.2 主要試劑與儀器

SPX-600 智能生化培養箱購自上海鴻都電子科技有限公司；DHP-9162電熱恒溫培養箱購自上海一恒科學儀器有限公司；腦心浸液肉湯、硫乙醇酸鈉肉湯無菌采樣瓶、大豆蛋白凍肉湯培養基均購自于廣東環凱微生物科技有限公司；化學純36%～38%鹽酸購自廣州化學試劑廠（批號：2021030216）。

1.3 水采樣點的設置及編號

設8個取水樣點。1、2號微電解儀的3個水龍頭是共同的終端出水實體。屏障設施內3 個終端水龍頭對應1號微電解儀的水樣標記為1號、2號、3號取樣點，對應2 號微電解儀的水樣標記為6 號、7 號、8 號；屏障設施外微電解機房的2 個取水點，即輸水管網回水取樣點（標記為4 號）和微電解出水進入輸水管網前取樣點（標記為5號）各1個。

1.4 水樣采集

超濾水采樣：確認微電解儀均處于關閉狀態，開啟，1、2、3 號終端出水口放水5 min，然后用酒精燈燒灼出水口，用采樣瓶以無菌操作的方法對上述取水點進行水樣采集，500 mL/瓶，每份水樣各2瓶。

微電解水采樣：開啟微電解儀1 h后采樣。采樣點包括3 個終端出水口（1 號微電解儀啟用時命名為1、2、3 號水樣；2 號微電解儀啟用時命名為6、7、8 水樣）、1 個輸水管網回水取樣點4 號、1 個微電解出水口至輸水管網前的取樣點5 號。對采樣出水口放水5 min，用酒精燈燒灼出水口，以無菌操作的方法采集水樣500 mL/瓶，每份水樣各2瓶。

酸化水采樣：對終端出水口的水人工添加36%～38%化學純鹽酸，達到pH測試紙值2.5～3，以無菌操作的方法采集水樣500 mL/瓶，每份水樣各2瓶。

1.5 樣品接種培養

過濾法檢測：依據《中華人民共和國藥典》2020版中純化水、注射用水的檢測方法。于水平流潔凈工作臺上進行操作。每份樣品隨機取其中1 瓶500 mL 水樣，經0.22 μm無菌薄膜過濾器濾過后，取出濾膜，菌面向上貼于R2A 瓊脂培養基，30～35 ℃培養至少5 d，觀察菌落數。

國標法檢測：依據國家標準GB 14925—2010《實驗動物環境及設施》、GB 14926.41—2001《實驗動物無菌動物生活環境及糞便標準的檢測方法》檢測。另1瓶500 mL水樣按無菌操作分別吸取0.5 mL樣品，分別接種到腦心浸液肉湯、硫乙醇酸鈉肉湯、大豆蛋白凍肉湯、血瓊脂平皿培養基中。其中，接種腦心浸液肉湯、硫乙醇酸鈉肉湯培養基后，置于（36±1）℃培養至少14 d，并在第7和第14天時采用革蘭染色法鏡檢；接種血瓊脂平皿后，放置35～37 ℃培育箱中48～72 h，觀察血瓊脂平皿中有無細菌生長，以及其菌落數；接種大豆蛋白凍肉湯培養基后，置于25～28 ℃培養至少14 d，觀察有無真菌生長。

1.6 結果判斷

光學顯微鏡下未觀察到細菌，同時R2A 瓊脂培養基和血瓊脂皿上無細菌生長，大豆蛋白凍肉湯培養基中無真菌生長，即判斷水質合格，無菌水符合無菌要求，結果表示為陰性“－”。任何一個培養基中出現陽性結果，即判斷為不符合無菌要求，結果表示為陽性“＋”。

2 結果

2.1 超濾水與微電解水的檢測結果對比

關閉微電解儀時，經過超濾處理的1、2、3 號水樣進行微生物檢測，結果均為陽性。開啟2 號微電解儀1 h 后，4、5、6、7、8 號水樣進行微生物檢測的結果均為陰性。兩種水樣采用過濾法的檢測結果與依據GB 14925—2010、GB 14926.41—2001國標檢測的結果一致，具體見表1。

表1 超濾水與微電解水的檢測結果比較Table 1 Comparison between ultrafiltration water and micro electrolysis water

2.2 微電解儀故障與正常運行期間的檢測結果

2018 年4 月～2022 年3 月跟蹤檢測期間，在編號為20180921 和20181011 的二次連續檢測時發現1、2、3 號終端出水口水樣有細菌，對應1 號微電解儀故障，此后增加備用微電解儀（命名為2 號微電解儀）；另外，在編號20210923 和20211215 的檢測時發現6、7、8 終端水樣有細菌，對應2 號微電解儀故障。結果提示，微電解儀正常運行時，終端水樣檢測結果為陰性；若微電解儀出現故障，終端水樣檢測結果為陽性（表2）。

表2 微電解儀故障時的水樣檢測結果Table 2 Detection result of water samples in case of failure of micro-electrolyzed sterile water system

2.3 微電解無菌水跟蹤監測微生物結果

2018 年4 月～2022 年3 月共進行17 次采樣檢測，除編號為20180921、20181011、20210923、20211215的終端水樣檢測有細菌（分別對應1號和2號微電解儀故障）外，其他時間的跟蹤檢測結果顯示微電解無菌水系統的終端出水口1、2、3、6、7、8水樣、回水口4水樣、微電解出水口5水樣、酸化水樣經培養14 d后均無細菌和真菌生長（表3），符合GB 14925—2010、GB/T 14926.41—2001國家標準。

表3 2018年4月—2022年3月微電解無菌水微生物檢測情況Table 3 Microbial detection of micro-electrolyzed sterile water from April 2018 to March 2021

3 討論

本中心所用的微電解無菌水系統在跟蹤前期的檢測結果顯示，僅經過超濾的水不能達到無菌，且在微電解儀故障時，所制終端水不能達到無菌；開啟微電解儀并正常工作1 h后所制水能達到無菌。國內有學者比較了反滲透實驗動物飲用水與高壓滅菌水，發現前者不能達到無菌［2-3］。不能保持所制水無菌的原因可能與反滲透膜、前置超濾膜自身微生物滋生以及輸水管道內、終端開放口微生物滋生有關。同時，前期的檢測水樣采用過濾法與國標法（水樣未經過濾）的檢測結果一致，因此在后期的跟蹤監測中采用了GB 14925—2010、GB/T 14926.41—2001 國家標準推薦的方法。

屏障設施無菌水系統均由滅菌環節、輸水管路、供水終端組成。目前，國內應用到屏障設施的無菌水系統主要有反滲透或+浸沒式紫外線、超濾（超濾+臭氧發生器+浸沒式紫外線）、在線滅菌。反滲透和超濾均是利用膜過濾法進行凈化水。反滲透可以截留9×101道爾頓的小分子，能有效清除溶解于水中的無機物、有機物、細菌、熱源等。超濾可以截留相對分子質量在1×103～1.5×105，不能過濾水溶性無機離子，也通常作為反滲透的前置過濾。但反滲透和超濾均需要防止過濾膜被細菌污染或堵塞，需定期監控并更換過濾膜，否則導致過濾失敗，系統滋生細菌［4-5］。也有學者認為，反滲透只可以去除大部分細菌，而不是全部［6］。同時這2 種系統的輸水管道以配置成循環管路為佳，而維持輸水管路內的無菌則是防止污染的關鍵點和難點。在線高溫滅菌是將水高溫滅菌結合降溫輸送，有文獻［2］報道其可以保持終端出水的無菌，但隨著在飲水瓶儲存時間延長，滋生細菌逐漸增多，同時能耗較高。微電解是通過改變電場強度，影響細菌的生理代謝而導致其死亡，同時水分子通過微電解發生強的氧化還原反應，并釋放活性物質［O］、HO2-、H2O2等自由基到循環水中發揮殺菌作用［1］。微電解的優勢是保持循環輸水系統持續存在強氧化活性物質而達到滅菌作用，尤其是可以持續保持輸水管路的無菌［1］；但將其灌裝飲水瓶后能維持多長時間的無菌，尚未做監測。本研究通過對微電解無菌水系統多年的跟蹤觀察發現，微電解無菌水系統的終端出水口水樣檢測無菌表明整個無菌水系統無菌；回水口水樣無菌表明輸水管路無污染；微電解出水口進入供水網管前水樣無菌表明微電解儀器工作正常；而酸化水監測結果保持陰性，是無菌水系統的第二屏障，可彌補無菌水不能實時監測帶來的污染風險。

屏障設施無菌水系統的污染環節主要發生在滅菌主機功能減弱或故障、膜過濾或輸水循環管路污染、單行無循環管路或供水末端的逆行污染、動物自動飲水嘴的逆行污染。本中心在對微電解無菌水系統的跟蹤監測過程中發現，取樣點的科學設置非常重要。因此在觀察中不僅設置了終端取水點，還設置了循環管路的回水取樣點和微電解儀出水口進入管網前的取樣點，以此達到對無菌水系統的各關鍵環節點起到準確監控作用。一旦發現污染，可以通過污染取樣點位置判斷無菌水系統污染發生的具體環節，即準確判斷是微電解儀器問題、輸水管路問題、終端水逆行污染還是取樣操作污染問題。通過幾年跟蹤觀察發現：微電解無菌水系統多以微電解儀發生故障導致殺菌失敗，在1號微電解儀工作時2次檢測陽性，維修發現電解極片結垢板結，在兩極片中形成隔離層，使微電解減弱或不能正常工作。因此，微電解儀的維護非常重要。微電解無菌水系統維護的關鍵點是：定期清洗除垢，每月一次，每500 L 加檸檬酸500 g，開啟微電解無菌水系統，使檸檬酸水在系統中循環保持1～2 h，減少礦物質等雜質在電極片上的結垢，保持陰極片、陽極片正常發揮電解作用；過濾膜定期更換，保安過濾每3個月、精過濾膜6 個月、超濾膜12 個月更換一次。過濾膜的配置起到攔截微量懸浮物和微小雜質顆粒以及部分微生物的作用，可實現水的預處理，減少電極片的結垢，但其不具備自凈功能，不能持續保持無菌。經2015—2017年［1］及近4年來的跟蹤監測發現，在微電解系統正常工作時，微電解儀出水口、輸水管路、終端出水均沒有污染，后期還設置了備用微電解儀器，交替使用，以確保生產屏障設施中動物飲用水和日常工作清潔用水的無菌。如沒有備用微電解儀且僅有的一臺微電解儀故障時，應用高壓滅菌水替代，以保障屏障設施內動物飲用水和日常工作用水符合無菌要求。

屏障設施中動物飲用水和日常用水一旦污染將直接導致動物和環境的污染，因此，維持并保持屏障設施無菌水系統的無菌顯得極其重要。經過多年跟蹤監測的結果表明，微電解無菌水在屏障設施中應用是可行的，但也存在一些關鍵的細節問題。一方面，無菌水僅僅靠微電解儀尚不能達到持續無菌，輸水管路的科學配置是極其關鍵的因素，必須設置循環回路，使微電解的殺菌物質在循環管路中持續保持。筆者了解到國內目前約25家實驗動物設施使用了微電解無菌水系統，另有2 家單位在嘗試應用微電解系統時發現所制水不能達到無菌而放棄使用，究其原因是配置的輸水管路沒有設置循環回路、輸水管網有過長過多盲端、輸水管網中形成旁通獨立閉環等，導致輸水管路死角和部分不能循環的水存在，管網中的水不能全部回流而重新進入微電解殺菌循環系統中，從而導致水中細菌的滋生。因此，在實驗動物屏障設施的設計規劃中，對無菌水系統中輸水管路的布局需要考慮循環輸水管路的設計，盡可能減少輸水死角。另一方面，目前的微電解無菌水系統沒有即時報警系統。本中心自2018年11 月起在系統中配置了在線微電解儀電流檢測表，以監控微電解儀產生的電流，小于或等于2 A時應立即停用，啟用備用機。此外，準確判斷仍然需要取水樣進行微生物檢測，歷時2～14 d才能報告結果，因此水質微生物檢測結果的判斷遲于污染發生的實際時間。未來工作中，將考慮利用微電解水中的主要滅菌成分設置在線檢測報警系統以達到實時監控的作用。