離體豚鼠回腸法應用于骨肽類注射劑中組胺類物質檢測

吳 暢, 李曉潔, 吳殷囡, 王 瑤, 汪玉馨, 宗衛峰, 孟長虹, 陸益紅

(1.徐州醫科大學藥物分析教研室,徐州 221004; 2.江蘇省食品藥品監督檢驗研究院,南京 210019)

組胺是一種活性胺化合物，在體內與組胺H1受體結合后，可致血管舒張、血壓下降、支氣管與胃腸道平滑肌收縮等生理反應［1］。藥品中的降壓物質主要是指組胺等能引起血壓下降的生物胺類物質，其含量超過規定的限度時，臨床上可引起生命體出現血壓下降、冷汗甚至休克等癥狀。貓降壓物質檢查法是指向實驗貓靜脈中注射限值劑量的供試品及組胺對照品，比較供試品與對照品引起的降壓程度，以此判定供試品中所含降壓物質的限值是否符合規定。而組胺類物質檢查法是將一定濃度的供試品和組胺對照品依次注入離體豚鼠回腸浴槽內，比較供試品與對照品所致的回腸收縮幅度，以判定供試品中組胺類物質含量是否符合規定。

《中國藥典》1985 年版首次收載了降壓物質檢查法，當時使用的實驗動物為貓或犬，一直沿用至2000年版；2005 年版則把所使用的實驗動物明確為貓，刪除了犬；發展至2010年版，在保留原有的降壓物質檢查法的基礎上，《中國藥典》第二部附錄《化學藥物注射劑安全性檢查法應用指導原則》增加了組胺類物質檢查項；《中國藥典》2015年版首次收載了組胺類物質檢查法（即豚鼠離體回腸收縮法），并明確貓降壓物質檢查法可以作為該方法的補充和相互替代方法。然而目前相關研究和報告較少，豚鼠離體回腸收縮法的選擇尚缺少相關標準依據。

骨肽類制劑是一類由動物骨骼提煉而成且具有生物活性的多組分生化藥物，部分制劑品種在制備工藝中還添加了全蝎、甜瓜子等動植物提取成分［2］，因其具有消炎鎮痛等作用，臨床主要用于骨質疏松癥、骨質增生、骨折及類風濕性關節炎等疾病的治療［2］。近年來，不良反應監測系統顯示，骨肽注射液會引起皮膚及其附件、呼吸系統等方面的不良反應，癥狀包括皮疹、發熱、胸悶、呼吸困難、血壓下降等［3］，并因其不良反應發生率較高而被錄入國家重點監控藥品目錄。

多組分生化藥物大多來自動物臟器的提取物，來源復雜，存在組分不明、結構不清的問題，有可能因臟器離體后組織出現自溶現象混入組胺、類組胺樣具有降壓作用、致敏反應的活性物質，從而影響藥物的治療效果并產生不良反應［4］。為保障用藥安全，針對上述存在安全風險的制劑及原料應建立降壓物質檢查項［5-6］，但由于我國實驗用貓一直難以標準化供給，實驗結果很容易受到較多因素干擾。本實驗擬探討采用組胺類物質檢查法（即離體豚鼠回腸法）替代貓降壓物質檢查法［7］的一致性和可行性，以期能夠為骨肽類注射劑的藥品質量控制和安全性評價，以及相關標準的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

離體器官儀ALC-MPA2000購自上海奧爾科特生物科技有限公司。

1.2 受試品

復方骨肽注射液來自江蘇企業A和B，各1批；骨肽注射液來自湖北企業C、黑龍江企業D和E，各1批；注射用骨肽來自黑龍江企業D，1批；注射用骨瓜提取物來自黑龍江企業E，1批。

1.3 試劑

磷酸組織胺對照品（批號150510-201313）購自中國食品藥品檢定研究院；氯化鈉（批號20200602）、氯化鉀（批號20150618）、氯化鈣（批號20120413）、氯化鎂（批號F20111220）、磷酸氫二鈉（批號20170306）、硫酸阿托品（批號1806161）、碳酸氫鈉（批號N15C009）和葡萄糖（批號20170928）均購自國藥集團化學試劑有限公司；戊巴比妥鈉（批號20140221）購自美國Sigma-Aldrich 公司；肝素鈉注射液（批號1200402）購自南京新百藥業有限公司；生理鹽水（即0.9%氯化鈉）注射液（批號8K82B1）購自中國大冢制藥有限公司；注射用水（批號1810414）購自上海信誼金朱藥業有限公司。

1.4 實驗動物

實驗用普通級虎皮貓體質量約3 kg，雄性，1 只；普通級豚鼠體質量約280～340 g，雌雄各半，共42只。實驗動物均購自無錫恒泰實驗動物養殖有限公司［SCXK（蘇）2020-0003］，其中實驗用豚鼠的實驗動物質量合格證編號為HT00277。動物飼養于江蘇省食品藥品監督檢驗研究院普通環境［SYXK（蘇）2017-0062］。本研究中動物實驗方案經江蘇省食品藥品監督檢驗研究院實驗動物福利倫理委員會審核批準（審查編號為JSIFDC2020-05）。

1.5 組胺類物質檢查方法

參照《中國藥典》2020年版中第四部通則第1146條組胺類物質檢查法（即離體豚鼠回腸法）進行實驗［8-9］。取體質量在280～320 g、禁食24 h的健康合格成年豚鼠，隨機分為7組，每組6只。用靜脈注射空氣法迅速處死豚鼠，立即剖腹取出遠端回腸，固定于離體器官儀ALC-MPA2000中。在離體器官儀的恒溫水浴槽中事先放入一定量的臨用時新配制的回腸肌營養液（取氯化鈉160.0 g、氯化鉀4.0 g、氯化鈣2.0 g、氯化鎂1.0 g與磷酸氫二鈉0.10 g，加純化水700 mL使溶解，再加入適量注射用水，使成1 000 mL。從上述配制溶液中取50.0 mL，與硫酸阿托品0.5 mg、碳酸氫鈉1.0 g、葡萄糖0.5 g 混勻，再加注射用水，使成1 000 mL，調節pH 值至7.3，即制得）［8］。隨后連續通入混合氣體（該氣體由95%O2和5%CO2組成），維持35 ℃的恒定溫度。精密稱取磷酸組胺對照品適量，按組胺計算，加水溶解成每1 mL中含1.0 mg的溶液，配制成一定量的組胺對照品溶液。精密量取上述組胺對照品溶液適量，用氯化鈉注射液按高、低劑量組（dS2、dS1）配成兩種濃度的稀釋液，高劑量dS2應不致使回腸收縮達到極限，低劑量dS1所致反應值約為高劑量的一半，調節劑量使反應可以重復出現。注入體積為0.2～0.5 mL，高低劑量的比值（r）為1∶0.5。調節劑量，使低劑量能引起回腸收縮，高劑量不致使回腸收縮達極限，且高低劑量所致回腸的收縮應有明顯差別。

由于實驗中供試品溶液dT（各批次骨肽注射液樣品按實驗要求稀釋后得到的溶液）的濃度與低劑量組胺對照溶液的濃度直接相關，具體計算公式如下：一般以人每千克體質量可接受的組胺限量（0.1 μg/kg）和人每千克體質量每小時臨床最大用量的供試品劑量的比值計算注射劑含組胺類物質的檢查限值。檢查限值（L）的計算公式如下：L=K/M。其中K為人每千克體質量可接受的組胺限量（0.1 μg/kg），M為人每千克體質量每小時的最大供試品劑量。以60 kg作為人均體質量計算。結合檢查限值（L）和低劑量組胺溶液的濃度（CSL） 計算出供試品的最小有效稀釋濃度（MVC），計算公式如下：MVC=CSL/L。式中：CSL 為低劑量組胺溶液的質量濃度（μg/mL）；L 為供試品組胺限值（μg/mg）。骨肽注射液的原溶液濃度較低，其對應的低劑量組胺溶液濃度引起豚鼠回腸收縮不明顯，因此低、高劑量對照品采用計算值的2 倍濃度進樣。結合制劑的臨床劑量及檢查要求，具體實驗的供試品溶液dT的給藥濃度見表1。

表1 離體豚鼠回腸法組胺類物質檢查實驗中給藥劑量Table 1 Experimental dose of histamine-like substances test by the isolated guinea pig ileum method

在每段豚鼠回腸中按照dS2、dS1、dT、dT、dS1、dS2的順序分別注入對照品稀釋液和供試品溶液，這兩種溶液的注入體積應相等。如果供試品溶液引起了一定程度上的回腸收縮，則將第2 個注入劑量dS1與第4 個注入劑量dT，第5 個注入劑量dS1與第3 個注入劑量dT所致的反應值各自進行比較。若兩次注入的dT所致反應值均不大于dS1所致反應值的一半，即認為供試品組胺類物質檢查呈陰性結果；若dT所致反應值大于dS1所致反應值的一半且小于dS1所致反應值，認為供試品組胺類物質檢查結果可疑；若dT所致反應值大于dS1所致反應值，則判定供試品組胺類物質檢查呈陽性結果。

1.6 降壓物質檢查方法

參照《中國藥典》2020年版中第四部通則第1145條降壓物質檢查法進行實驗［8-9］。用戊巴比妥鈉將實驗用貓麻醉后，固定于保溫手術臺上，分離氣管，在一側頸動脈插入連接測壓計的動脈插管，管內充滿適宜的抗凝劑溶液，以記錄血壓。在一側股靜脈內插入靜脈插管，供注射藥液用。全部手術完畢后根據藥典要求檢查貓的靈敏度，當實驗用貓經檢查后對降壓物質的靈敏度符合藥典要求，則可進行下一步實驗，即取對照品溶液（dS）劑量按0.10 μg/kg體質量計算，供試品溶液（dT）以臨床單次用藥劑量的0.2～5 倍作為降壓劑量限值［9］。具體給藥劑量和靜脈注射體積見表2。按照dS、dT、dT、dS這樣的次序注射4 個劑量為一組，然后將第一與第三個劑量，第二與第四個劑量所致的反應值分別進行比較。如果劑量dT所致的反應值均不大于劑量dS所致反應值的一半，判定供試品的降壓物質檢查結果呈陰性。否則應按上述次序繼續注射一組4個劑量，并按相同方法將兩組內各對dS、dT劑量所致的反應值分別進行比較。如果dT所致反應值大于dS所致反應值的一半且小于dS所致反應值，認為供試品降壓物質檢查結果可疑。如果dT劑量所致的反應值大于dS劑量所致的反應值，則認為供試品的降壓物質檢查呈陽性結果。因此，結合制劑的臨床劑量及檢查要求，具體實驗的給藥劑量見表2。

表2 貓降壓物質檢查實驗給藥劑量Table 2 Experimental dose of cat depressor substance test

2 結果

2.1 組胺類物質檢查結果

將5家企業共7批骨肽類注射劑分別根據表1中給藥劑量進行實驗，得出的結果顯示有3 批制劑的組胺類物質檢查結果呈陰性，4批制劑結果可疑。截取其中較為典型的回腸收縮反應值變化進行比較可見，相較于回腸收縮反應不明顯的陰性批次，可疑批次會出現較為明顯的回腸收縮反應，見圖1。

圖1 兩種典型骨肽類注射劑中組胺類物質的檢查結果比較Figure 1 Comparison of histamine-like substance test between the two typical osteopeptide injections

其中企業A的復方骨肽注射液、企業C和E的骨肽注射液、企業E 的注射用骨瓜提取物致回腸收縮的反應值均大于組胺對照品所致反應值的一半，且小于組胺對照品所致反應值，提示結果可疑。具體結果見表3。

表3 7批骨肽類注射劑用組胺類物質檢查法檢測結果Table 3 Results of histamine-like substance test in 7 batches of osteopeptide injections

2.2 降壓物質檢查結果

降壓物質檢查法實驗中給藥劑量參照表2。檢測結果表明，同上述組胺類物質檢查法檢測結果可疑的4批骨肽類制劑，企業A 的復方骨肽注射液在其等效劑量的0.6 倍、企業C 的骨肽注射液在其等效劑量的1.5倍時降壓實驗結果可疑，企業E 的骨肽注射液在其等效劑量的1.5 倍、注射用骨瓜提取物在其等效劑量的0.3倍時致麻醉貓血壓下降的程度大于對照品所致反應量，結果呈陽性。其余3 批制劑的結果呈陰性，具體見表4。

表4 7批骨肽類注射劑用降壓物質檢查法檢測結果Table 4 Results of depressor substance test in 7 batches of osteopeptide injections

截取其中有代表性的貓血壓變化圖進行比較，可見結果為陰性的批次致貓血壓變化不太明顯，而結果為可疑或陽性的批次都會導致貓血壓出現較為明顯的下降，見圖2。

圖2 三種不同的典型骨肽類注射劑降壓物質檢查結果比較Figure 2 Comparison of depressor substance test among the three typical osteopeptide injections

2.3 組胺類物質檢查與降壓物質檢查結果比較

將組胺類物質檢查法（即離體豚鼠回腸法）與貓降壓物質檢查法的實驗結果比較，發現組胺類物質檢查結果為陰性的骨肽類注射劑，其降壓物質檢查實驗的結果也為陰性。企業A 的復方骨肽注射液、企業C的骨肽注射液和企業E 的注射用骨瓜提取物在組胺類物質檢查中結果為可疑，降壓物質檢查結果也為可疑；企業E的骨肽注射液在組胺類物質檢查中結果為可疑，在降壓物質檢查中結果為陽性。7批骨肽類注射劑采用兩種方法檢測的具體結果比較見表5。

表5 7批骨肽類注射劑經組胺類物質檢查與降壓物質檢查的結果比較Table 5 Comparison between histamine-like substance test and depressor substances test on 7 batches of osteopeptide injections

3 討論

本研究參照《中國藥典》2020 年版中第四部通則第1146條組胺類物質檢查法和第1145條降壓物質檢查法分別進行實驗。組胺類物質檢查結果表明5 家企業共7批骨肽類注射劑有4批制劑結果可疑，分別為企業A的復方骨肽注射液、企業C的骨肽注射液、企業E的骨肽注射液及注射用骨瓜提取物。對照貓降壓物質檢查結果，上述4批制劑中企業A的復方骨肽注射液、企業C 的骨肽注射液和企業E 的注射用骨瓜提取物的檢查結果同樣為可疑，企業E 的骨肽注射液檢查結果呈陽性。其余3 批制劑經組胺類物質檢查與貓降壓物質檢查的結果均呈陰性。綜上，骨肽類注射劑7 個批次的貓降壓物質檢查結果與組胺類物質檢查結果相比較，其中有6個相同批次的結果一致，只有1批企業E的骨肽注射液組胺類物質檢查結果為可疑，而降壓物質檢查結果為陽性。考慮到動物的個體差異及靈敏度，以及不同種屬在劑量換算及判定標準中存在一定偏差，鑒于兩種測定方法在陰性結果及可疑結果檢出較為一致，總體實驗結果一致率為85.7%（6/7），可以認為基于離體豚鼠回腸法的組胺類物質檢查法在骨肽注射劑的質量控制中，可作為貓降壓物質檢查法的替代和補充。但是，骨肽注射液中引起豚鼠回腸收縮的物質基礎究竟源于產品自身還是產品中成分刺激機體或組織釋放產生，還需進一步研究。

國內外藥典收載的降壓物質檢查方法略有不同，而各國藥典大多僅收載貓降壓實驗，部分藥典同時收載貓降壓實驗和豚鼠回腸實驗［8-13］。因貓具有比較耐受麻醉、血壓恒定、對組胺類物質反應靈敏、血管壁堅韌、便于手術操作和可反復應用等優點，相較于兔與比格犬等實驗動物更適用于降壓物質檢查實驗［14-17］。但目前實驗用貓的培育標準尚未統一，具有生產資格的單位較少［14，18］，價格較高，無法滿足藥品常規降壓物質檢查的需求，多數實驗室采用的為市售家貓。家貓來源復雜，個體間差異大，健康水平參差不齊，無法對微生物寄生蟲等進行控制，可能給實驗操作者帶來較大安全隱患；此外，實驗過程中存在動物有效保溫、實驗環境控制等較多不可控因素［19-20］。組胺類物質檢查法采用豚鼠離體回腸為實驗對象，動物來源、質量穩定可控，符合動物實驗的3R原則［21］，且技術操作易于掌握，還能有效避免內源性血壓調節類物質對實驗結果的影響，故可作為貓降壓物質檢查法的替代和補充。

藥品制劑的安全性檢查對控制藥品質量、保障用藥安全具有重要意義。骨肽類注射劑為多組分生化注射劑，提取工藝簡單，但質量可控性不夠［22］，制備過程中可能混入組胺或類組胺樣降壓活性物質，影響藥物的療效或引起不良反應。因此，對骨肽類注射劑中的組胺類物質應予以重視［23-24］。對于成分復雜的多組分藥物，應根據其主要成分及臨床應用選擇適宜的檢查方法。部分提取自植物的注射劑中存在有機酸等化學成分，直接靜脈注射即會引起急性降壓，導致貓降壓物質檢查法結果為假陽性，對組胺類物質的判斷產生干擾。因此，該類注射劑宜采用離體豚鼠回腸法進行組胺類物質檢查或驗證。某些中藥注射劑中存在平滑肌興奮或抑制劑類成分，影響離體豚鼠回腸法的結果判斷，故該類注射劑仍然推薦采用貓降壓物質檢查法。