枸杞多糖對尼羅羅非魚生長發育、消化酶活性及腸道組織形態的影響

陶云開　高雪梅　袁宗偉　郭忠寶　陳詔　張旭　陳少翠　唐瞻楊　黃婷

摘要：【目的】明確枸杞多糖對羅非魚機體生長發育及消化功能的影響，為羅非魚健康養殖提供理論參考，同時為促進羅非魚養殖產業的可持續健康發展提供新思路。【方法】在尼羅羅非魚基礎飼料中添加5個不同劑量（0～2000 mg/kg）的枸杞多糖，進行40 d的養殖試驗后測量尼羅羅非魚的體重及全長，計算相對增重率（WG）、相對增長率（LG）、特定生長率（SGR）和飼料系數（FCR），采用ELISA試劑盒分別檢測淀粉酶（Amylase）、蛋白酶（Protease）及脂肪酶（Lipase）活性，并采集前腸、中腸和后腸組織制作切片，通過光學顯微鏡觀察腸道組織形態的變化特征?！窘Y果】于基礎飼料中添加不同劑量枸杞多糖對尼羅羅非魚的生長發育均起促進作用，其中以添加1500 mg/kg處理組的促進效果最佳，至養殖試驗結束時尼羅羅非魚的終末全長、終末體重、WG、LG和SGR均達最高值，分別為13.45 cm、48.74 g、6.96%、0.94%和5.19%/d;而FCR最小，僅為1.88。尼羅羅非魚中腸組織的蛋白酶和淀粉酶活性在1500 mg/kg處理組中顯著升高（P<0.05，下同），胃組織的蛋白酶和淀粉酶活性、肝臟組織的脂肪酶活性也是以1500 mg/kg處理組最高，但與對照組（0 mg/kg）相比無顯著差異（P>0.05）。腸絨毛長度在尼羅羅非魚前腸組織中以1500 mg/kg處理組的最短（0.351 mm）、在后腸組織中則以1500 mg/kg處理組的最長（0.320 mm），與對照組（0 mg/kg）相比差異顯著;肌層厚度在前腸和中腸組織中均以500 mg/kg處理組的最厚，分別為0.089和0.087 mm，在后腸組織中則以1000 mg/kg處理組的最薄（0.065 mm）、2000 mg/kg處理組的最厚（0.099 mm）?！窘Y論】枸杞多糖可提高羅非魚的消化酶活性，改善其腸道組織形態，從而影響羅非魚的生長發育，且以添加劑量為1500 mg/kg的效果最佳。

關鍵詞： 尼羅羅非魚;枸杞多糖;生長發育;消化酶;腸道組織形態

中圖分類號： S965.125? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）02-0577-08

Effects of Lycium barbarum polysaccharides on growth， digestive enzyme activity and intestinal tissue morphology

of Nile tilapia （Oreochromis niloticus）

TAO Yun-kai GAO Xue-mei YUAN Zong-wei GUO Zhong-bao CHEN Zhao ZHANG Xu CHEN Shao-cui TANG Zhan-yang HUANG Ting

（1Guangxi Aquatic Products Breeding Center， Nanning? 530031， China; 2Guangxi Academy of

Fishery Sciences， Nanning? 530021， China）

Abstract：【Objective】This study clarified the effects of Lycium barbarum polysaccharide（LBP） on the growth， development and digestive function of tilapia. The research results provided theoretical reference for healthy tilapia aquaculture and new ideas for promoting the sustainable and healthy development of tilapia aquaculture industry. 【Method】Five different doses （0-2000 mg/kg） of LBP were added to the basic feed of Nile tilapia for a 40-day breeding experiment. After the experiment， the body weight and full length of Nile tilapia were measured to calculated the relative weight gain rate （WG）， relative growth rate （LG）， specific growth rate （SGR） and feed coefficient （FCR）. ELISA kits were used to detect the activities of amylase， protease and lipase. The foregut， midgut and hindgut tissue sections of the experimental fish were prepared to observe the changes of intestinal tissue morphology. 【Result】Adding different doses of LBP to the food could promote the growth and development of Nile tilapia. The group supplemented with 1500 mg/kg had the best promo-ting effect， and the final full length， final body weight， WG， LG and SGR reached the highest， which were 13.45 cm， 48.74 g， 6.96%， 0.94% and 5.19%/d， respectively. FCR was the smallest， only 1.88. The activities of protease and amylase in midgut tissue significantly increased in 1500 mg/kg treatment group （P<0.05， the same below）. The activities of protease and amylase in stomach tissue activities of lipase in liver tissue were also the highest in 1500 mg/kg treatment group. The However，there was no significant difference compared with the control group （0 mg/kg） （P>0.05）. The villus length of the foregut tissue was the shortest （0.351 mm） and the villus length of the hindgut tissue was the longest （0.320 mm） in the 1500 mg/kg treatment group， representing significante difference compared with the control group （0 mg/kg）. The muscle layer thickness in the foregut and midgut tissues were the thickest in the 500 mg/kg treatment group， at 0.089 and 0.087 mm， respectively. The muscle layer thickness of hindgut tissue was the thinnest （0.065 mm） in the 1000 mg/kg treatment group， and? was the thickest （0.099 mm） in the 2000 mg/kg treatment group. 【Conclusion】LBP can promote the growth and development of Nile tilapia by increasing the activity of digestive enzymes and improving the morphology of intestinal tissue. Adding 1500 mg/kg LBP to the feed has the best effect.

Key words：Nile tilapia; Lycium barbarum polysaccharide; growth and development; digestive enzyme; intestinal tissue morphology

Foundation items： National Modern Agriculture Industry Technology System Construction Project （CARS- 46）

0 引言

【研究意義】水產養殖業的蓬勃發展，不僅促進了社會經濟的增長，還解決了大量的就業難題。據估計，未來30年全球人口總數將持續增加，水產養殖業在解決蛋白食品需求量不斷增加等問題中發揮著重要作用（Manage，2018）。尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）由于生長速度快、出肉率高，已發展成為全世界養殖最多的魚類之一。近年來，羅非魚產量持續增加，預計到2030年世界范圍內的羅非魚總產量將達730萬t（Behera et al.，2018;Hien et al.，2018）。抗生素等化學藥物在羅非魚養殖過程中常用于改善其生長性能，然而大量化學藥物的使用，極易造成嚴重的環境污染（Armstrong et al.，2005）。Mesalhy和Albutti（2014）研究認為，過量使用抗生素養殖羅非魚會通過食物鏈對人體健康產生不良影響。Xin等（2019）研究報道，抗生素等新興污染物使用量的不斷增加，將嚴重威脅羅非魚產業的可持續發展。中藥富含生物堿及揮發油等活性物質，在促進水生動物生長發育、提高消化水平和增強抗應激能力等方面發揮重要作用，且具有來源廣、成本低、無藥物殘留、毒副作用小、不產生抗藥性等優點。因此，探究中藥在羅非魚養殖中的使用效果，對推進羅非魚產業的可持續發展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來，中藥在水產養殖業中得到廣泛應用且效果良好。Citarasu（2010）研究認為，中藥在魚類的生長發育和刺激消化等方面具有積極的作用;Radhakrishnan等（2014）研究發現，中藥可提高羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）的消化能力，提高其生長性能;Elabd等（2016）研究證實，投喂甘草和黃芪能有效提高鱸魚（Perca flavescens）的生長參數;Huang等（2020）研究發現，在飼料中添加適量中藥混合物劑可顯著改善歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）的生長性能、消化酶活性及血清生化指標;He等（2020）研究表明，中藥可增強鯽魚（Carassius auratus auratus）的抗病能力。枸杞（Lycium barbarum）多糖是枸杞子中最重要的藥用成分，其主要成分為鼠李糖、葡萄糖及半乳糖等多種糖類，是一種糖—蛋白聚合物，因具有天然的抗氧化及促進酶合成等生物活性，在改善機體生長發育、提高消化水平等方面具有重要作用（劉英娟等，2015;孫甜甜等，2018;張琛等，2021）。王大會等（2020）指出，枸杞多糖可增強餌料誘食效果，提高水產動物的生產性能，并改善其肉質。袁增寶等（2020）研究表明，枸杞多糖可提高鯉魚（Cyprinus carpio）對飼料的利用率并促進其生長。【本研究切入點】目前，有關枸杞多糖在羅非魚機體生長發育及消化等方面的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】對比分析不同枸杞多糖添加劑量下羅非魚生長性能、消化酶活性和腸道組織形態的差異，探討枸杞多糖對羅非魚機體生長發育及消化功能的影響，為羅非魚健康養殖提供理論參考，同時為促進羅非魚養殖產業的可持續健康發展提供新思路。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試尼羅羅非魚由廣西水產科學研究院特色淡水魚綜合試驗基地提供，選取體表無傷痕、活力強、大小均一的個體進行飼養試驗。試驗開始前將尼羅羅非魚置于水溫（28.0±0.5）℃、pH 8.0的條件下暫養7 d。供試基礎飼料購自百洋產業投資集團股份有限公司，基礎飼料營養水平見表1。枸杞多糖購自上海源葉生物科技有限公司，規格為50% UV，顏色呈棕色，粉狀，易吸潮。

1. 2 試驗方法

參照Eman等（2014）的方法，設計5個枸杞多糖添加劑量（G1～G5），分別為0（G1，對照）、500（G2）、1000（G3）、1500（G4）和2000（G5）mg/kg。將枸杞多糖溶于水后均勻噴涂在基礎飼料表面，飼料混合均勻晾干后，置于干燥處低溫保存（Brum et al.，2018）。按枸杞多糖添加劑量共設5個處理組，每處理組3個重復，每個重復50尾尼羅羅非魚。試驗開始時將750尾尼羅羅非魚（體重6.12±2.75 g、全長6.92±0.49 cm）隨機平均分到15個150 L的水箱中，保持養殖環境與暫養環境一致，進行40 d的養殖試驗。試驗用水為曝曬自來水，養殖期間每3 d換水1次。每天9：00和17：00各飽食投喂1次，投食1 h后將剩余飼料撈出，曬干稱重并記錄。

1. 3 指標測定

1. 3. 1 生長指標測量 養殖試驗結束時，測量尼羅羅非魚的體重及全長，計算相對增重率（WG）、相對增長率（LG）、特定生長率（SGR）和飼料系數（FCR）（馬釗等，2020;張宇航等，2020），計算公式如下：

WG（%）=（W-W）/W×100

LG（%）=（L-L）/L×100

SGR（%）=（lnW-lnW）/t×100

FCR=W/（W–W）

式中，W為初始體重（g），W為終末體重（g），W為飼料消耗量，L為初始全長（cm），L為終末全長（cm），t為養殖時間（d）。

1. 3. 2 消化酶活性檢測 養殖試驗結束時，對所有試驗魚饑餓處理24 h，每處理組隨機取3尾尼羅羅非魚，采用MS-222進行麻醉處理，然后迅速在冰盤上采集肝臟、胃和中腸組織，置于-80 ℃冰箱暫存以備消化酶活性檢測。按照ELISA試劑盒（江蘇澤雨生物科技有限公司）說明檢測淀粉酶（Amylase）、蛋白酶（Protease）和脂肪酶（Lipase）活性。

1. 3. 3 腸道組織形態分析 尼羅羅非魚饑餓處理24 h后，每處理組隨機選取3尾進行MS-222麻醉處理，迅速解剖采集前腸、中腸和后腸組織，各腸段長度約1 cm，浸入pH 7.2～7.4的磷酸鹽緩沖液中清洗內容物，使用4%多聚甲醛通用型組織固定液（Biosharp）固定24 h（王壇等，2019）。參照Zhang等（2017）制作組織切片的方法，將固定好的樣品經脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、蘇木精—伊紅（H-E）染色等過程制作腸道組織橫斷面切片，每個組織制作5張石蠟切片。最后使用光學顯微鏡對每張腸道組織切片進行觀察拍照，每個組織選取拍照效果較好的3張切片備用。在備用的每張腸道組織切片中，隨機選取3根完整絨毛以Image-Pro Plus 6.0分別測量絨毛高度（mm）和肌層厚度（mm），并求取平均值。

1. 4 統計分析

試驗數據采用SPSS 17.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）及Duncan’s多重比較，并以GraphPad Prism 5.0進行繪圖。

2 結果與分析

2. 1 枸杞多糖對尼羅羅非魚生長發育的影響

由表2可知，于基礎飼料中添加不同劑量枸杞多糖對尼羅羅非魚的生長發育均起促進作用，其中以G4處理組的促進效果最佳，至養殖試驗結束時尼羅羅非魚的終末全長、終末體重、WG、LG和SGR均達最高值，分別為13.45 cm、48.74 g、6.96%、0.94%和5.19%/d，與G1、G2和G3處理組的差異達顯著水平（P<0.05，下同）。FCR以G4處理組的最?。?.88），其次是G5處理組（2.23），二者差異不顯著（P>0.05，下同）。

2. 2 枸杞多糖對尼羅羅非魚消化酶活性的影響

由圖1可知，經過40 d的養殖各處理組尼羅羅非魚肝臟中的蛋白酶活性無顯著差異;G2～G5處理組的中腸組織蛋白酶活性均顯著高于對照組（G1），尤其以G4處理組最高，達524 U/L;在胃組織中，G4處理組的蛋白酶活性也最高，達532 U/L，但與對照組相比無顯著差異，而G3和G5處理組顯著低于G4處理組。在尼羅羅非魚肝臟中，各處理組間的淀粉酶活性也無顯著差異;在中腸組織中，G2～G5處理組的淀粉酶活性均顯著高于對照組，尤其以G4處理組最高，達4139 mU/L;在胃組織中，G4處理組的淀粉酶活性也最高，達6303 mU/L，但與對照組相比無顯著差異。在尼羅羅非魚肝臟中，脂肪酶活性以G4處理組最高，達8247 mU/L，與對照組間無顯著差異，但顯著高于G5處理組;在中腸和胃組織中，脂肪酶活性均以G3處理組的最高，分別為4457和4131 mU/L，但各處理組間的差異均不顯著。

2. 3 枸杞多糖對尼羅羅非魚腸道組織形態的影響

腸道是魚類消化和吸收營養的主要場所，可分為黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層。腸絨毛是腸道內部營養物質消化吸收的主要部位，而肌層主要作用于腸道蠕動，促進食物的推進及排放。因此，腸絨毛長度及肌層厚度直接影響著營養物質的吸收與運輸。各處理組尼羅羅非魚前腸、中腸、后腸組織的形態特征如圖2所示。由尼羅羅非魚前腸、中腸、后腸組織切片的腸絨毛長度和肌層厚度測量值繪制曲線（圖3）可知，與對照組相比，腸絨毛長度在尼羅羅非魚前腸組織中以G4處理組的最短（0.351 mm）、G2處理組的最長（0.526 mm），二者差異顯著;在中腸組織中，腸絨毛長度排序為G1處理組>G5處理組>G2處理組>G4處理組>G3處理組，即G3處理組的腸絨毛長度最短，為0.298 mm;在后腸組織中，腸絨毛長度排序為G4處理>G5處理>G3處理>G1處理>G2處理，以G4處理組的腸絨毛長度最長，為0.320 mm，與對照組相比差異顯著。在肌層厚度方面，前腸的肌層厚度排序為G2處理組>G4處理組>G5處理組>G3處理組>G1處理組，其中，G2～G5處理組肌層厚度均顯著高于對照組，以G2處理組的最厚（0.089 mm）;中腸的肌層厚度排序為G2處理組>G5處理組>G4處理組>G1處理組>G3處理組，也是以G2處理組的最厚，為0.087 mm;在后腸組織中則以G3處理組的最?。▋H為0.065 mm），以G5處理組的最厚（0.099 mm），具體排序為G5處理組>G4處理組>G1處理組>G2處理組>G3處理組。綜上所述，以G2處理組前腸的腸絨毛最長，G4處理組后腸的腸絨毛最短，且各處理組的后腸腸絨毛均較前腸、中腸的腸絨毛短。在肌層厚度方面，以G5處理組的后腸肌層最厚，G1處理組的前腸肌層最薄，且各處理組的后腸肌層均較前腸、中腸的肌層厚。

3 討論

多糖是機體的主要成分之一，幾乎參與整個生命過程。枸杞多糖是一種由多種酸性雜多糖和多肽或蛋白構成的復合多糖，因具有天然的抗氧化、抗病毒等生物活性，在畜牧業和水產養殖生產中的應用前景廣闊（譚連杰等，2019）。利用枸杞多糖提高動物的生產性能是多糖研究領域的熱點之一。已有研究表明，枸杞多糖可改善養殖動物的生長性能，在飼料中添加2 g/kg枸杞多糖對草魚（Ctenopharyngodon idella）的WG、FCR和SGR均有顯著促進作用（Wing et al.，2016），添加10 g/kg枸杞多糖可顯著提高石斑魚的WG和SGR（Tan et al.，2019）。李宇敏等（2018）研究發現，飼料中添加不同劑量的枸杞多糖可不同程度促進獺兔的生長發育。本研究結果顯示，在基礎飼料中添加1500 mg/kg枸杞多糖可顯著提高羅非魚的WG、LG和SGR，降低其FCR，與前人的研究結果（Wing et al.，2016;Tan et al.，2019）相似。

蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶等內源性消化酶在動物營養物質消化方面發揮重要作用，其活性嚴重影響著水產動物的消化水平（Mohamed et al.，2019）。已有研究表明，在仿刺參（Apostichopus japonicas Selenka）體內注射枸杞多糖可顯著提高其腸道消化酶活性和生長性能（樊英等，2014）。類似研究結論在枸杞多糖對肉雞等其他動物的研究中也得到證實（Long et al.，2020）。本研究結果表明，尼羅羅非魚中腸組織的蛋白酶和淀粉酶活性在1500 mg/kg處理組中顯著升高，表明飼料中添加1500 mg/kg枸杞多糖可提高羅非魚的消化能力。多糖的結構組分與其生理功能密切相關，枸杞多糖復雜的結構組分和構象特征決定其生物學功能的多樣性（Talarico et al.，2005;孫甜甜等，2018）。故推測枸杞多糖在尼羅羅非魚中腸組織中利用不同組分間的結構修飾，有效改善羅非魚腸道組織中的消化酶活性，從而提高對飼料的利用率，促進其生長發育。

腸道是魚類進食后消化吸收的重要器官，腸絨毛作為腸道內部消化吸收的主要部位，其長度決定了腸道內部消化吸收的表面積（朱傳忠等，2018）。Caspary（1992）研究認為，腸絨毛長度增加促使小腸接觸營養物質的面積增大，從而增強小腸對營養物質的吸收，即腸絨毛形態與機體生長發育密切相關。本研究發現，在基礎飼料中添加1500 mg/kg枸杞多糖后尼羅羅非魚后腸絨毛長度最長，表明羅非魚的消化吸收能力最強，生長發育最快。此外，發現在基礎飼料中添加枸杞多糖對尼羅羅非魚前腸、中腸的絨毛長度無顯著促進作用。魚類進食后營養物質在腸道內的流動速度和消化率與腸道肌層厚度密切相關（Smirnov et al.，2004）。肌層厚度影響腸道肌肉的蠕動能力，肌層越厚蠕動能力越強，越有利于腸道內物質的運輸（麥浩彬等，2020），反之，較薄的肌層減少了腸道蠕動速度，增加食物在腸道內的停留時間，從而延長營養吸收的時間（Liu et al.，2018）。前人研究表明，枸杞多糖不同組分間的構象可改善前腸組織細胞的增殖分化，促使其分泌更多分泌物以促進消化吸收（樊英等，2014）。本研究結果發現，在基礎飼料中添加1500 mg/kg枸杞多糖能有效提高羅非魚前腸的肌層厚度，且此時生長性能最佳。故推測飼料中添加的枸杞多糖促進了前腸組織細胞的增殖分化，從而促使其前腸肌層厚度增加，提高食物在羅非魚前腸中的運輸速度，同時促進前腸組織分泌物的產生及食物在下游消化道的消化吸收，有效提高消化效率。由于枸杞多糖存在特殊的結構組成和構象差異，其含有的-COOH和-NH等基團還會促進腸道組織細胞發生凋亡（樊英等，2014）。本研究在基礎飼料中添加1000 mg/kg枸杞多糖后，尼羅羅非魚后腸組織肌層厚度顯著降低，推測是-COOH和 -NH等基團的促凋亡作用致使羅非魚后腸肌層厚度變薄，從而延長食物在腸道內的停留時間，提高營養物質的吸收效率，最終促進羅非魚的生長發育。

4 結論

枸杞多糖可提高羅非魚的消化酶活性，改善其腸道組織形態，從而影響羅非魚的生長發育，且以添加劑量為1500 mg/kg的效果最佳。

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（責任編輯 蘭宗寶）