基于網絡藥理學及分子對接探討經典名方保元湯治療慢性心力衰竭的作用機制

刁元元 邱智東 張宇航 石羽文 李軍鴿 賈艾玲，2

(1長春中醫藥大學藥學院，吉林 長春 130117；2成都中醫藥大學藥學院)

慢性心力衰竭(CHF)是心臟結構和功能的異常改變所導致，呼吸困難、身體疲乏和液體滯留是其表現形式，也是各種心臟疾病的嚴重表現或晚期階段〔1〕。近些年，我國心血管疾病的發病率明顯上升，心血管病占居民疾病死亡構成的40%以上，成為中國居民死亡的主要原因，因此心力衰竭已成為我國重大的公共衛生問題和解決心血管疾病的重大挑戰〔2，3〕。現代醫學已建立的CHF治療是基于管理降低射血分數，包括藥理學策略和非藥理學策略，如心臟再同步治療(CRT)裝置或植入式心律轉發器、除顫器(ICD)及生活方式的改變〔4〕。CHF康復專家共識指出〔5〕，通過運動進行規律的心臟康復，患者運動耐力可以得到明顯改善，生活質量也明顯提高。同時輔以中醫藥治療，從整體觀念入手，辨證論治，降低西藥帶來的不良反應，使CHF的治療更加安全有效。

保元湯(BYD)名列《古代經典名方目錄(第一批)》，收錄于《簡明醫彀》(明·孫志宏)，其方為人參一錢，黃芪二錢，甘草五分，肉桂二分，又加生姜一片，水煎服〔6〕。在BYD中，人參和黃芪補益元氣，甘草調和諸藥，肉桂溫通血脈，生姜溫中助陽，全方補益元氣，健脾護肺溫腎，可治一切元氣虛弱之證〔7〕。早期古籍記載，BYD主要治療小兒痘瘡類，歷代醫家廣泛應用于元氣虛弱的治療，現今臨床上常用保元湯加減方來治療心血管系統、免疫系統、虛喘及婦產科等疾病〔8〕。CHF在中醫角度屬于氣血不足，心力衰竭開始于心肺，以心為主，逐步累及肺、肝、脾、腎，作為補氣方劑代表，BYD在治療患者疾病過程中安全性高，副作用小，能有效改善心臟供血和心肌代謝功能，促進患者的康復〔9，10〕。

網絡藥理學是在系統層面結合網絡信息數據庫及相關計算機作圖軟件，將化合物-靶點-通路網絡可視化的新興綜合學科，網絡藥理學與傳統中醫藥相結合，與中醫的“整體觀”和“辨證施治”的原則相契合，同時與中藥“多成分-多靶點-多途徑”的系統網絡分析相類似〔11，12〕。本研究通過網絡藥理學的方法系統闡述經典名方BYD治療CHF的作用機制。

1 材料與方法

1.1BYD有效活性成分的收集與篩選 利用中藥系統藥理學分析平臺TCMSP收集人參、黃芪、甘草、肉桂、生姜的成分。根據口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18篩選活性成分，收集相應靶點，刪除無明確作用靶點，得到活性成分。同時，提取其蛋白質靶點并將靶點蛋白信息標準化。

1.2CHF疾病相關靶點篩選 在人類基因數據庫GeneCards中檢索 “chronic heart failure”相關的疾病靶點，與BYD中收集到的靶點取交集后，最終獲得BYD治療CHF的潛在靶點。為明確BYD中活性成分靶點與 CHF 疾病靶點間的關系，獲得BYD活性成分靶點與 CHF 靶點的交集基因。

1.3構建有效成分-疾病靶點網絡 將BYD藥材活性成分靶點與交集基因通過Cytoscape3.7.2軟件構建活性成分-疾病靶點網絡圖，結合靶點度值對該網絡進行可視化分析，明確藥物、靶點與疾病的關系。

1.4構建交集基因蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)分析網絡 PPI是一種用于尋找靶點間相互作用的途徑。將交集基因導入STRING數據庫，構建PPI網絡圖。

1.5KEGG和基因本體(GO)富集分析 通過DAVID數據庫對交集基因進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。將富集結果導入在線作圖平臺中進行可視化展示。

1.6分子對接分析 通過pubchem網站獲取BYD中主要化合物槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇的SDF結構文件，利用Open Babel2.3.2軟件將SDF文件轉為PDB文件，從Protein Data Bank數據庫中檢索獲得受體蛋白白細胞介素(IL)-6(PDBID： 1ALU)、腫瘤壞死因子(TNF，PDBID： 5MU8)、血管內皮生長因子(VEGF)A(PDBID： 4KZN)，利用PYMOL2.3.4軟件和AutoDockTools軟件對受體蛋白進行修飾。

2 結 果

2.1BYD活性成分篩選 在TCMSP中檢索并篩選人參、黃芪、甘草、肉桂、生姜的有效成分，去除重復成分后，得到符合條件的活性成分133個。使用Uniprot數據庫，將靶點名稱轉為基因名稱，匯集總數，除去重復靶點后共獲得潛在靶點144個。

2.2疾病靶點篩選 檢索GeneCards數據庫得到與 CHF 相關的靶點共9 382個，與BYD中的靶點取交集后，最終獲得BYD治療 CHF 的潛在靶點共140個。

2.3主要活性成分-疾病靶點網絡分析 網絡圖中共包含296節點(其中藥物節點5個，疾病節點1個，有效成分節點137個，靶點節點153個)，3 312條邊。其中靶點對應黃色，藥物有效成分對應綠色，BYD中的中藥顯示為粉色，疾病對應藍色。根據網絡可視化分析結果可知，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、刺芒柄花素、異鼠李素等為度值較高的有效活性成分，見圖1。

2.4PPI網絡構建 將BYD中治療CHF的140個靶點導入STRING數據庫，隱藏斷開的節點，得到PPI網絡圖，如圖2，共涉及139個節點，1 433條邊，平均節點數為20.6，平均局部聚類系數為0.521。度值排名前5的關鍵蛋白為IL-6、VEGFA、TNF、TP53、表皮生長因子(EGF)。

2.5GO分子功能富集結果與KEGG通路富集分析 GO富集分析得到184個GO條目(P<0.05，FDR<0.05)，生物過程(BP)條目119個、細胞成分(CC)條目24個、分子功能(MF)條目41個，各選取P值最小的前10個進行繪圖呈現，結果顯示，這些蛋白在生物過程方面主要涉及對藥物的反應、細胞增殖的正調控、對乙醇的反應等過程；細胞組分方面主要參與細胞外間隙、質膜、突觸后膜等過程；在分子功能方面主要參與酶結合、藥物結合、類固醇激素受體、類固醇結合等過程，見圖3。可推測出BYD在治療CHF時可能與以上功能過程相關；KEGG通路富集分析得到112條通路(P<0.05，FDR<0.05)，主要有神經活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、癌癥的途徑、藥物代謝-細胞色素P450、TNF信號通路、膀胱癌、cGMP-PKG信號通路等，富集分析結果前15的通路見表1。

圖1 藥物-有效成分-靶點網絡

圖2 BYD與CHF疾病PPI網絡

圖3 GO富集分析氣泡

表1 KEGG通路富集分析排名前15的通路信息

續表1 KEGG通路富集分析排名前15的通路信息

2.6分子對接驗證 選取BYD治療CHF的主要活性成分槲皮素、山奈酚和β-谷甾醇及PPI網絡前3位核心靶點，利用PYMOL2.3.4軟件和AutoDockTools軟件進行分子對接和可視化處理。圖4顯示了受體蛋白IL-6、TNF、VEGFA與BYD中主要活性成分beta-sitosterol、Kaempferol、quercetin配體小分子之間的結合模式。結果顯示結合能力良好，見表2。

圖4 BYD主要活性成分與關鍵蛋白分子對接

表2 BYD治療CHF核心成分與關鍵靶點的分子對接結果

3 討 論

臨床研究表明，中醫藥在CHF的心臟康復治療中效果顯著，BYD作為補益心氣類的經方代表，在改善心臟舒張收縮功能、血流動力學方面及炎癥因子方面均有顯著作用〔13〕。

根據主要活性靶點網絡圖，BYD治療CHF發揮作用的主要有效成分為黃芪和甘草中的槲皮素、刺芒柄花素和異鼠李素，人參、黃芪和甘草中含有的山奈酚、人參和生姜中的β-谷甾醇。槲皮素是人類飲食中常見的類黃酮類物質，在心血管系統保護方面有一定療效，包括抗炎、抗氧化和血管舒張，研究發現槲皮素對于血管平滑肌具有多重抑制作用，通過轉錄因子(NF)-κB和AP-1抑制TNF-α誘導的人主動脈平滑肌(HASMC)增殖、G1～S期細胞周期進程和基質金屬蛋白酶(MMP)-9的表達〔14〕。槲皮素一般和糖結合，槲皮素3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(Q3GA) 是人體血漿中主要的槲皮素結合物之一，Q3GA能特異性抑制血小板衍生生長因子(PDGF)誘導的血管平滑肌細胞JNK和AKT的激活及由此產生的細胞遷移和增殖，對AngⅡ誘導的平滑肌細胞(VSMC)肥大的預防作用部分歸因于其對JNK和AP-1信號通路的抑制作用，在心血管預防方面有一定療效〔15〕。山奈酚和刺芒柄花素兩種成分相互協作，能抑制缺氧條件下H9c2心肌細胞內活性氧水平及NADPH氧化酶亞基NOX4、p67phox、p47phox表達量，調控氧化應激水平，達到防治 CHF 的目的〔16〕。β-谷甾醇通過誘導大鼠體內線粒體呼吸產生的活性氧促進細胞內谷胱甘肽氧化還原循環，此反應對缺氧/復氧誘導的H9c2細胞凋亡具有保護作用〔17〕。研究表明β-谷甾醇通過介導PPARc/NF-κB信號通路的調節，達到對離體H/R誘導的心肌細胞損傷和載體心肌I/R損傷的保護作用〔18〕。異鼠李素是從中草藥中提取的黃酮類活性化合物，通過激活磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路和誘導血紅素加氧酶(HO)-1的產生達到抑制小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成，對動脈粥樣硬化病癥有良好治療效果〔19〕。BYD中的這些主要成分在治療CHF過程中可能發揮了主要作用。

通過PPI網絡分析，篩選出BYD的核心靶點共有139個。包括IL-6、VEGFA、TNF、TP53、EGF等。IL-6是一種細胞因子，IL-6水平的緩慢升高會導致慢性炎癥和纖維化，最新研究表明，短期IL-6信號可以保護心臟組織，長期過度產生的IL-6信號或IL6R蛋白在心血管疾病中起致病作用〔20〕。VEGFA是一種內皮細胞特異性有絲分裂原，在多種體內模型中也是血管生成的誘導劑，在生殖和骨血管生成時起到作用〔21〕。TNF-α拮抗劑目前成為治療克羅恩病、類風濕關節炎和其他慢性全身炎癥性疾病患者的有效療法，特別是在心力衰竭的研究中，抗TNF-α水平對于心血管方面存在一定療效〔22〕。TP53及其下游靶點TP53誘導的糖酵解和凋亡調節因子TIGAR對心臟代謝和細胞起到調節作用〔23〕。EGF是血管生成的核心因子，促進血管生成〔24〕。綜上所述，在治療CHF時，BYD可能通過調節關鍵靶點表達來達到疾病治療效果。

KEGG富集分析涉及的通路有神經活性配體-受體相互作用、鈣信號通路等。通過對比冠狀動脈旁路移植術(CABG)手術前后患者的心房樣本的微陣列剖面數據分析可知，部分通過調節神經活性配體-受體相互作用的途徑在術后的患者中對心臟保護起重要作用〔25〕。黃芪中的有效物質可改善失調的鈣泵功能失調，達到對心肌細胞的一種保護作用〔26〕。在充血性心力衰竭兔中作用于心室肌細胞內Ca2+超載和鈣振蕩的機制能明顯減弱兔的心臟功能和電重構嚴重發生〔27〕。

綜上，BYD中主要化學成分槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、刺芒柄花素、異鼠李素等主要化合物可能通過作用于IL-6、VEGFA、TNF、TP53、EGF等關鍵蛋白和神經活性配體-受體相互作用、鈣信號通路等主要通路，干預心血管相關的生物過程，從而發揮治療作用，為更加深入研究BYD的藥效物質奠定基礎。