外周血單個核細胞miR-132對老年急性髓系白血病預后的預測價值

張榮耀 李娜 李慧 張露璐 萬楚成 (十堰市太和醫院血液內科，湖北 十堰 442600)

急性髓系白血病(AML)是一種造血系統的惡性克隆性疾病，患者主要特征為骨髓原始細胞異常積累及正常血細胞生成障礙〔1〕。AML主要高發于60歲以上老年人群，近些年來雖然隨著治療技術的不斷進步，臨床療效得到了顯著提高，但由于老年患者器官代謝功能的下降及伴隨的基礎疾病較多等因素，老年AML患者的總體治療預后仍然較差〔2，3〕。微小RNA(miRNA)作為一種廣泛存在于機體內的短鏈非編碼RNA，miRNA在細胞生長、器官病變及免疫反應等多種生物學過程中均發揮重要作用，同時多項研究顯示，miRNA的異常表達與癌癥(包括AML)的發生發展具有密切關系〔4，5〕。miR-132作為miRNA重要的成員，學者發現AML患者可出現miR-132異常表達，且miR-132具有診斷AML的能力〔6〕。然而，miR-132表達是否可預測老年AML患者治療預后目前尚無相關研究報道。本研究擬分析外周血單個核細胞miR-132對老年AML預后的預測價值。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇2014年3月至2018年4月十堰市太和醫院收治的老年AML患者83例，其中男51例，女32例，年齡60～79歲，平均(67.28±5.42)歲。此外，選擇同期在十堰市太和醫院行骨髓標本檢驗的非白血病老年人50例為對照組，其中男29例，女21例，年齡60～76歲，平均(67.07±6.12)歲。兩組性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準：①參照世界衛生組織造血和淋巴組織腫瘤分類標準(2008年版)相關診斷標準〔7〕，確診為初發AML患者；②未接受任何治療，包括放療、化療、靶向治療或內分泌治療；③患者無血液系統疾病史；④患者自愿簽署知情同意書。排除標準：①AML復治者；②明確有中樞神經系統侵犯者；③急性早幼粒細胞白血病者；④心、肝、腎等機體主要器官功能障礙者；⑤合并嚴重感染、惡性腫瘤或自身免疫系統疾病史。研究經醫院倫理委員會批準。

1.2治療方案 患者采取地西他濱+高山尖杉酯堿+阿糖胞苷化療方案。

1.3外周血單個核細胞miR-132檢測 抽取兩組外周靜脈血4 ml(AML患者于治療前檢測)，置于乙二胺四乙酸二鉀抗凝管內，使用密度梯度法分離外周血單個核細胞。在全血中加入等體積生理鹽水稀釋，然后緩慢加入淋巴細胞分離液，2 261 r/min離心20 min，取中間的白色環狀層，加入生理鹽水緩和均勻，4 378 r/min離心10 min，棄去上清后留取細胞備用。加入細胞裂解液，使用Trizol試劑提取單個核細胞中總RNA，并檢測總RNA純度。取1 μg總RNA使用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA，采用熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)進行擴增。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，使用U6作為內參基因，miR-132上游引物：5′-GCCCGTAACAGTCTACAGCCAT-3′，下游引物：5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應條件：95℃ 1 min，94℃ 30 s、56℃ 30 s、74℃ 30 s，共進行40個循環，每個樣品設置3個復孔。使用2-△△Ct法計算外周血單個核細胞miR-132相對表達量。

1.4資料收集 收集并記錄AML患者臨床資料，包括性別、年齡、白細胞(WBC)計數、血紅蛋白(Hb)濃度、血小板(PLT)計數、細胞遺傳學、首次治療緩解情況。

1.5隨訪 采取門診來院隨訪、電話隨訪等多種形式，隨訪截止日期為2020年4月1日，計算患者總體生存時間(OS)：從治療開始到末次隨訪或死亡的時間。

1.6統計學分析 采用SPSS22.0統計學軟件進行t檢驗、χ2檢驗及Logistic回歸分析，生存情況繪制Kaplan-Meier生存曲線，組間生存情況比較采用Log-rank檢驗，采用受試者工作特征(ROC)曲線分析miR-132對患者預后的預測價值。

2 結 果

2.1兩組外周血單個核細胞miR-132相對表達量比較 AML組外周血單個核細胞miR-132相對表達量(1.974±0.372)顯著高于對照組(1.263±0.215；P<0.05)。

2.2影響患者預后的單因素分析 年齡、染色體核型、首次治療情況及外周血單個核細胞miR-132相對表達量與患者OS有關(P<0.05)，見表1。

2.3影響患者預后的多因素Logistic回歸分析 對上述單因素分析具有統計學意義的各因素進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，染色體核型、外周血單個核細胞miR-132相對表達量及首次治療情況進行回歸模型(P<0.05)，為影響患者預后的獨立危險因素，見表2。

表1 影響患者預后的單因素分析(個月)

表2 預后的多元Logistic回歸分析

2.4不同miR-132表達患者生存情況比較 miR-132低表達(<1.974)患者生存情況顯著優于miR-132高表達患者(≥1.974，P<0.05)。見圖1。

2.5不同預后患者外周血單個核細胞miR-132相對表達量 根據患者隨訪情況，將隨訪OS超過12個月作為預后良好組，OS不足12個月作為預后不良組，其中預后良好組miR-132相對表達量(1.872±0.225)顯著低于預后不良組(2.176±0.281；P<0.05)。

2.6miR-132對患者預后預測價值 采用ROC曲線預測患者預后，結果顯示，曲線下面積為0.875，95%CI0.757～0.922，靈敏性90.36%，特異性85.54%，最佳截斷值為2.216，見圖2。

圖1 miR-132不同表達患者的生存情況

圖2 miR-132在患者中的預后價值

3 討 論

AML是成年人最為常見的急性白血病類型，約占成年人急性白血病的80%〔8〕。有研究報道顯示，AML患者5年生存率僅為30%～40%，且老年AML患者生存率更低，僅20%左右，主要由于老年患者合并疾病較多，其對化療耐受性較差，因此老年AML患者相關的早期死亡率較高〔3，9〕。AML是骨髓造血系統的惡性腫瘤性疾病，具有高度的異質性，患者預后差別較大，尋找有效的指標對患者臨床預后進行有效預測，對于治療方案的及時調整及患者預后的改善具有重要作用〔10，11〕。miRNA作為廣泛存在并參與機體多種生理功能的高度保守鍛煉RNA，可在機體中穩定存在，而當機體受到內環境、外環境影響或在多種疾病發生發展過程中，miRNA可出現異常表達，成為多種疾病早期診斷及預后評估的重要參考指標，而關于miRNA對AML患者預后的預測價值，目前相關研究較為鮮見〔12，13〕。

miR-132定位于人染色體17p13.3基因間區，miR-132具有高度保守序列，研究顯示〔14，15〕，miR-132與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關。本研究結果與相關研究報道結果相似〔16，17〕，提示miR-132在AML疾病發生過程中發揮一定的調控作用。

本研究結果提示了除常規認為的染色體核型及首次治療是否獲得完全緩解以外，外周血單個核細胞miR-132相對表達量同樣是影響患者總體生存情況的獨立危險因素。與相關研究報道結果相似〔18，19〕，miRNA可能是AML發生發展的調控因素之一，可成為AML臨床診斷治療及預后預測的潛在指標。此外，本研究結果提示，miR-132可能調控AML疾病的發生發展，且可能通過相應的基因調控機制與多藥耐藥、高危細胞遺傳學等多種因素相關，但具體的研究機制還需要深入研究分析。

但由于本研究納入樣本量較小，且針對miR-132對AML相關調控機制進行深入研究分析，提示進一步研究還需擴大樣本量并進行相應的調控機制分析，以獲得更為可靠的研究數據，供臨床參考運用。

綜上，老年AML患者外周血單個核細胞miR-132表達異常升高，且miR-132表達與患者預后密切相關，可作為患者預后預測的潛在生物學指標之一。