老年癲癇患者急性發作后血漿外泌體長鏈非編碼RNA MIR155HG的檢測水平及意義

韓永凱 張萍 李斯娜 李靜 王旭生 張帆 杜愛玲 張留莎 宋景貴

(新鄉醫學院第二附屬醫院 1神經內科，河南 新鄉 453002；2急診科；3新鄉醫學院第三附屬醫院神經內科)

老年癲癇是指60歲或65歲以后發病的癲癇，發作時常伴有認知、精神、社會學等諸方面功能障礙，癲癇急性發作后可能會造成不可逆的腦損傷，又因患者為老年人群，因此致殘率和病死率都很高〔1〕。目前臨床常采用許多量表對老年癲癇患者病情及預后進行評估，但其準確性和及時性難以滿足臨床需求，因此，急需簡便、準確評估老年癲癇患者短期預后的臨床指標〔2〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)MIR155HG是長度為1 500 bp的LncRNA，因其為miR-155的宿主基因而得名〔3〕。目前，已有研究表明血清外泌體中miR-155與癲癇發生有密切聯系，然而未見LncRNA MIR155HG與癲癇相關性的報道〔4〕。外泌體廣泛分布于血液、腦脊液等體液中，在許多生理病理過程中起著重要作用〔5〕。本研究通過檢測老年癲癇患者血漿外泌體中LncRNA MIR155HG表達水平，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年5月至2019年6月因癲癇急性發作于新鄉醫學院第二附屬醫院神經內科門診就診、住院的159例老年癲癇患者，納入標準：①符合癲癇診療指南中的診斷標準〔6〕；②病歷資料齊全者；③有頭顱CT或磁共振成像(MRI)等神經影像學腦電圖結果者；④年齡>60歲者。排除標準：①僅有一次臨床發作者；②因低血糖或肝、腎等臟器病變因素引起抽搐患者；③患腦出血、腦腫瘤等引起抽搐患者；④腦電圖有癇性放電但臨床發作不典型者。所有患者由主治醫師明確診斷，本試驗經醫院臨床研究倫理委員會批準，符合倫理學標準，所有受試對象家屬由專業人員詳細告知研究內容并自愿參加，并簽署知情同意書。根據隨訪期間是否發生預后不良將患者分為預后不良組(76例)和預后良好組(83例)，其中預后不良組年齡60～87歲；預后良好組年齡60～86歲。兩組性別、年齡、體重指數(BMI)、吸煙史、飲酒史、文化程度、蒙特利爾認知評估(MoCA)量表評分差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

1.2主要試劑與儀器 白細胞介素(IL)-2、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號：JK-a-1494)、IL-6 ELISA試劑盒(貨號：JK-a-0023)、IL-8 ELISA試劑盒(貨號：JK-a-1002)、IL-1β ELISA試劑盒(貨號：JK-a-1438)、腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒(貨號：JK-a-0016)均購自上海晶抗生物工程有限公司；exoRNeasy serum/plasma Midi kit(貨號：77044)，購自上海浩洋生物科技有限公司；miScript SYBR?Green qPCR Kit(貨號：218076)，購自德國QIAGEN公司；AceQ qPCR SYBR?Green Mix(貨號：Q111-02)，購自南京諾唯贊生物科技有限公司，CFX384實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)儀，購自美國Bio-Rad公司。

表1 兩組一般資料比較

1.3研究方法

1.3.1樣品采集及保存 抽取老年癲癇患者急性發作后24 h內清晨空腹靜脈血樣置于EDTA-K2抗凝真空管中，3 000 r/min離心15 min后收集血漿，置于-80℃保存待測。

1.3.2一般資料收集 查閱門診及住院病歷，收集患者一般資料，包括性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史、文化程度(低：小學及以下；中：初高中；高：大學及以上)；通過MoCA量表對患者進行認知功能評估，該量表涉及8個認知領域的評估，其中包括命名、語言、注意、空間與執行功能、回憶、延遲、抽象和定向力。MoCA總分為30分，當受試者受教育年限<12年時，在測試得分的基礎上加1分，校正由教育程度產生的偏倚，得分越高認知功能越好。

1.3.3qRT-PCR檢測血漿外泌體LncRNA MIR-155HG水平 采用qRT-PCR檢測老年癲癇患者血漿外泌體中LncRNA MIR155HG表達水平。采用exoRNeasy試劑提取血漿外泌體總RNA，反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。采用qRT-PCR儀對LncRNA MIR155HG及其內參GAPDH進行擴增，引物序列：LncRNA MIR155HG正向：5'-TGGAACAAATTGCTGCCGTG-3'，反向5'-AGGTTGAACATCCCAGTGACC-3';GAPDH正向：5'-ATTTGGCTACAGCAACAGGGTG-3'，反向：5'-TGGTTGAGCACAGGGTACTTTATTG-3'。qRT-PCR體系共20 μl：cDNA(50 ng/μl)2 μl，miScript SYBR?Green Mix 10 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，ddH2O 6.4 μl，引物由上海生工生物公司合成。反應條件：95℃預變性5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環。每份樣品均設3個重復孔，采用2-ΔΔCT法計算血漿外泌體LncRNA MIR155HG相對表達量。

1.3.4血漿細胞因子水平檢測 采用ELISA檢測老年癲癇患者血漿IL-2、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.5隨訪 患者隨訪1年，以其癲癇發作頻率較就診前的改變為標準判斷發作的變化狀況，無癲癇發作83例作為預后良好組，發作次數無減少或較前較少<50%(或患者病情未得到改善甚至加重)76例作為預后不良組。

1.4統計學方法 采用SPSS23.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、Pearson相關分析、Logistic回歸分析，采用受試者工作特征曲線(ROC)分析血漿外泌體LncRNA MIR155HG水平對老年癲癇患者預后不良的預測價值。

2 結 果

2.1兩組血漿外泌體LncRNA MIR155HG水平比較 預后不良組血漿外泌體中LncRNA MIR155HG水平(1.54±0.41)明顯高于預后良好組(1.00±0.23，P<0.05)。

2.2兩組血漿細胞因子水平比較 預后不良組血漿中IL-2、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平明顯高于預后良好組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組血漿細胞因子水平比較

2.3預后不良組老年癲癇患者血漿外泌體LncRNA MIR155HG與血漿細胞因子水平相關性 預后不良組老年癲癇患者血漿外泌體LncRNA MIR155HG與血漿IL-2(r=0.486，P=0.006)、IL-6(r=0.493，P=0.005)、IL-8(r=0.508，P=0.002)、IL-1β(r=0.483，P=0.006)、TNF-α(r=0.514，P=0.001)水平呈正相關。

2.4血漿外泌體LncRNA MIR155HG水平對老年癲癇患者預后不良的預測價值 以血漿外泌體LncRNA MIR155HG水平為檢驗變量繪制ROC曲線，結果顯示，血漿外泌體LncRNA MIR155HG水平預測老年癲癇患者預后不良的曲線下面積(AUC)為0.852(95%CI:0.790～0.915)，截斷值為1.171，特異性為79.5%，敏感度為85.5%。見圖1。

圖1 血漿外泌體LncRNA MIR155HG水平 預測老年癲癇患者預后不良的ROC曲線

2.5影響老年癲癇患者預后不良的多因素分析 將老年癲癇患者是否發生預后不良作為因變量，以血漿外泌體LncRNA MIR155HG水平及血漿IL-2、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示LncRNA MIR155HG、TNF-α是影響老年癲癇患者預后不良的獨立危險因素。見表3。

表3 影響老年癲癇患者預后不良的多因素分析

3 討 論

癲癇是諸多因素引起大腦神經元異常放電所致的短暫性腦功能失調病，可見于各年齡段，且兒童癲癇發病率高于成人〔7〕。而進入老年期后，由于老年癡呆、腦血管疾病及神經系統退行性病變增多，癲癇的發病率又隨之上升〔8〕。老年人癲癇通常是指60歲以上老年人出現至少2次的癇性發作，又因老年人基礎疾病較多，癲癇急性發作后易造成高致殘率和死亡率，給老年癲癇患者及家庭帶來沉重的心理和經濟負擔，同時對社會產生較多負面影響〔9,10〕。

老年人癲癇的發病機制尚未明了，但以免疫學發病機制研究較多〔11,12〕。癲癇患者存在免疫異常，且其體液中部分細胞因子的變化也處于異常狀態〔13〕。外泌體是細胞產生的小于150 nm的雙層膜結構囊泡，可參與包括阿爾茲海默病、帕金森病在內的多種腦部疾病的發生和發展，因此血漿外泌體的研究可能對老年癲癇有重要意義〔14〕。LncRNA可通過表觀遺傳修飾與轉錄后加工等多種機制在細胞生命活動中發揮作用，且在先天性和獲得性免疫系統中，對免疫細胞的激活和分化發揮重要調節作用〔15〕。LncRNA MIR155HG是miR-155的宿主基因，LncRNA MIR155HG中包含有miR-155的前體序列，已有研究表明，miR-155在癲癇的免疫炎癥機制中發揮重要作用〔16,17〕。本研究結果提示LncRNA MIR155HG與老年癲癇患者的預后有密切聯系，可能作為癲癇治療的新靶點，推測可能是LncRNA MIR155HG作為miR-155的宿主基因，同樣有調節炎性血腦屏障的白細胞黏附及廣泛的促炎作用，可進一步加重患者病情，影響老年癲癇患者預后，增加預后不良概率。劉丹丹等〔18〕研究表明細胞因子在癲癇發病過程中發揮重要作用，IL-2為Th細胞應激狀態下分泌的一種糖蛋白，可促進淋巴細胞增生和生存，調節適應性免疫反應〔19〕；IL-6為早期炎癥因子，在炎癥、感染及患腫瘤過程中可能會發揮免疫作用〔13〕；IL-8由巨噬細胞產生，其水平上升可能會增加局部組織的炎癥反應〔20〕；IL-1β的異常分泌通常與一些常見的自身免疫性疾病的發生有關〔21〕；TNF-α可加劇腦內炎癥反應，影響神經元的興奮性，引起疾病反復發作〔13〕。本研究結果與李超等〔22〕研究結果接近，也和李欣等〔23〕研究中血清細胞因子在癲癇患者中的表達趨勢一致。推測預后不良組老年患者中各類血漿細胞因子水平上升，加劇腦內炎癥反應，破壞血腦屏障，引起疾病的反復發作，造成不良預后。而本研究Pearson相關分析結果進一步表明血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達水平的變化可為評估老年癲癇患者病情及預后提供一定依據。此外，本研究提示作為影響老年癲癇患者預后不良的危險因素，血漿外泌體LncRNA MIR155HG對預后具有重要的提示作用，且當其表達量>1.171時，老年癲癇患者發生預后不良的概率可能更大。

綜上，血漿外泌體LncRNA MIR155HG與血漿細胞因子水平均有一定的相關性，表明在臨床診治過程中，老年癲癇急性發作后血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達水平的變化可為評估病情及預后提供一定依據。但LncRNA MIR155HG水平影響老年癲癇患者預后的具體機制仍不十分明確，需進一步深入研究。且本研究樣本數量較小，范圍局限，需加大樣本量進一步研究。