益脈降脂湯含藥血清對THP-1源性泡沫細胞增殖活性和膽固醇含量的影響

古展鑫 盧夢月 劉銳 劉付昌盛 劉華盛

(廣西中醫藥大學 1研究生院，廣西 南寧 530000；2附屬瑞康醫院老年病科)

中國心血管病患病率仍在逐年上升，并未見放緩趨勢〔1〕。動脈粥樣硬化(AS)是一種緩慢進展性疾病，它是心血管疾病的主要病理改變之一。AS發病的病理生理過程復雜，與炎癥浸潤、內皮損傷、氧化應激反應及免疫等各種因素密切相關〔2～4〕，其中，由動脈管壁上各種脂質成分累積而產生斑塊是AS形成的關鍵環節。因此，如何抑制巨噬細胞吞噬氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、改善泡沫細胞的脂質代謝，抑制巨噬細胞泡沫化成為防治AS的關鍵。

中醫無AS病名，但依據其血脂異常的發病病因，可歸屬中醫的“痰濁”“膏脂”等范疇。其基本病機以脾腎不足為本，痰瘀互結為標的本虛標實之證。痰瘀互結浸潤血脈是其主要病理特征。益脈降脂湯是針對AS脾虛痰濁、肝腎虧虛、痰瘀互結浸潤血脈等病機特征，以健脾化痰、滋補肝腎、活血化瘀為主要治療原則，辨證與辨病結合，標本兼顧。全方有健脾泄濁，滋補肝腎，活血通絡之功效。方中黃芪、白術、茯苓、澤瀉健脾化痰泄濁；黃精、何首烏、杞子滋補肝腎，丹參活血祛瘀，通利血脈，血行則痰自去；焦山楂消食和胃；菊花、草決明清肝瀉火；絞股藍有明顯降血脂作用，為辨病用藥。前期臨床研究表明，益脈降脂湯能顯著降低總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)〔5〕，還能降低C反應蛋白，改善血液流變學指標水平〔6〕，從而改善AS。為進一步闡明益脈降脂湯改善脂質代謝的作用，本研究建立泡沫細胞模型，探討益脈降脂湯含藥血清對泡沫細胞增殖活性和膽固醇含量的影響。

1 材料與方法

1.1動物與細胞 30只SPF級SD雌性大鼠，體重(180±20)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物合格號：SCXK(湘)2018-0002，飼養于廣西中醫藥大學動物實驗中心；人急性白血病單核細胞系THP-1，源于ATCC，購自卓一生化(廣西)技術有限公司。

1.2實驗藥物 益脈降脂湯由黃精20 g、山楂20 g，白術10 g，茯苓10 g，丹參10 g，澤瀉10 g，絞股藍10 g，何首烏10 g，黃芪10 g，杞子10 g，菊花10 g，草決明10 g組成，由廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院藥劑科制備提供，分別制成含生藥1.42、2.84、5.68 g/ml〔大鼠按10 ml/(kg·d)容積灌胃時，相當于成人等效劑量、2倍劑量、4倍劑量〕備用。阿托伐他汀鈣片(立普妥)購自桂中大藥房，生產批號：H20051408，使用前研磨粉碎，配制成含阿托伐他汀鈣0.2 mg/ml〔大鼠按10 ml/(kg·d)容積灌胃時，相當于成人等效劑量〕備用。

1.3主要試劑與儀器 主要試劑：Gibco RPMI1640培養基(Gibco公司，C11875500BT)；澳洲進口胎牛血清(Gibco公司，10099141C)；ox-LDL(北京Solarbio公司，H7950-2 mg)；佛波酯(PMA，北京Solarbio公司，SP9830-1 mg)；TC測定試劑盒(北京普利萊生物公司，SJ-E1015)；噻唑藍(MTT,北京Solarbio公司，M8180-250 mg)；飽和油紅O染色液(北京Solarbio公司，G1260-500 ml)。主要儀器：生物安全柜〔青島海爾(特種)，HR1200-ⅡB2〕；CO2細胞培養箱(日本Sanyo公司，MCO-18AIC)；倒置顯微鏡(德國Leica公司，DMI3000B)；高速離心機(美國Thermo公司，ST-16R)；全波長酶標儀(美國 Biotek，Epoch Biotek)。

1.4含藥血清制備 將SD大鼠30只，隨機分成益脈降脂湯(中藥)高、中、低劑量組及阿托伐他汀鈣(西藥)組、生理鹽水(空白對照)組各6只；適應性喂養1 w。灌胃時各組每日給藥1次，連續7 d。次日晨再灌胃1次，末次給藥1 h后，無菌條件下自腹腔動脈采血。將各組全血標本靜置3 h后，以3 000 r/min 4℃離心15 min，取同組血清混勻置于56℃水浴中30 min滅活，過濾除菌后EP管分裝。-20℃低溫冰箱冷藏備用。

1.5THP-1細胞培養及誘導分化 生長狀態良好的THP-1細胞使用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養基在37℃、5%CO2條件下培養細胞；使用終濃度為320 mmol/L的PMA混勻共同孵育細胞，誘導其分化為巨噬細胞，24 h后顯微鏡下拍照觀察。

1.6泡沫細胞建立及鑒定 將THP-1細胞刺激誘導分化為具有吞噬能力的巨噬細胞后，繼以終濃度為80 mg/L的ox-LDL完全培養液，于37℃，5%CO2的條件下的恒溫恒濕培養箱共同孵育48 h，最終建立泡沫細胞模型。

1.7油紅O染色方法 將飽和油紅O染色液與PBS按3∶2比例配制，用濾紙除雜質；用純水配制60%異丙醇，備用；將培養好的各組細胞取出，各孔棄上清，PBS緩慢沖洗2遍，加入4%多聚甲醛固定20 min。棄液后，每孔使用1 ml 60%異丙醇沖泡1 min，后棄去；使用配制好的油紅O染色液著色20 min。棄染色液，加入1 ml異丙醇分化10～15 s，PBS洗滌2次；蘇木素復染2 min，后棄液，PBS洗滌2次，將細胞爬玻片取出，濾紙吸干水液。取載玻片，滴注甘油明膠，蓋上細胞爬玻片，輕輕按壓使之貼合不留氣泡，倒置顯微鏡下觀察染色情況。

1.8MTT比色法檢測各組細胞增殖活性 取對數生長期狀態良好的THP-1細胞，用10%FBS完全培養基制成細胞懸液，調整細胞濃度為7×104～8×104/ml，加入PMA使細胞懸液終濃度含320 mmol/L的PMA，種于96孔板，每孔100 μl，每組10個復孔。放至37℃、5%CO2條件的誘導分化24 h后貼壁。24 h后除巨噬細胞組加入10%FBS完全培養基外，其余各組分別加入含80 mg/L的ox-LDL 10%FBS完全培養基，使其余各組變成泡沫細胞，建模成功后將巨噬細胞組和模型組加入空白對照組血清，西藥組及中藥高、中、低劑量組加入相應劑量的10%含藥血清，設含藥血清干預時間梯度為12、24、48 h。在各時間段干預結束后，每孔加入10 μl MTT溶液，避光繼續孵育4 h。后每孔加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，震蕩5～10 min后放至全波長酶標儀，吸收波長為490 nm，測定各孔OD值，分析益脈降脂湯含藥血清對巨噬細胞泡沫化增殖活性的影響。

1.9細胞內TC含量測定 取對數生長狀態良好的THP-1細胞重懸細胞懸液，調整細胞濃度為1×106/ml，每孔2 ml，種于6孔板，經由PMA誘導24 h后貼壁。除巨噬細胞組外，其余各組細胞再由80 mg/L的ox-LDL刺激48 h后，轉變為泡沫細胞。將巨噬細胞組和模型組加入空白對照組血清，西藥組及中藥高、中、低劑量組加入相應劑量的含藥血清，使含藥血清終濃度為10%，設定含藥血清干預時間為12、24、48 h 3個干預時間點。各干預時間結束后嚴格按照試劑盒說明書步驟檢測細胞內TC含量。

1.10油紅O染色觀察含藥血清對泡沫細胞脂質蓄積的影響 取對數生長期狀態良好的THP-1細胞，用10%FBS完全培養基制成細胞懸液，調整細胞濃度為1×106/ml，種于6孔板，每孔2 ml，每組種板前在孔內放置1片爬玻片，以便后續染色后觀察細胞。誘導分化24 h后取出六孔板，棄上清，除巨噬細胞組加入10%FBS完全培養基外，其余各組分別加入含80 mg/L的ox-LDL 10%FBS完全培養基，使其余各組變成泡沫細胞，將巨噬細胞組和模型組加入空白對照組血清，西藥組及中藥高、中、低劑量組加入相應劑量的10%含藥血清；各組血清干預48 h后，取各組細胞爬玻片，進行油紅O 染色，甘油明膠封片后，倒置顯微鏡下觀察各組細胞脂質蓄積情況，染色區域面積用油紅O染色面積比重〔Area(%)〕表示，其數值越大，表示染色區域越大，即細胞內脂質蓄積越明顯。

1.11統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、LSD法、單因素方差分析。

2 結 果

2.1THP-1細胞刺激誘導形成的巨噬細胞形態 經濃度320 mmol/L的PMA刺激誘導THP-1細胞24 h后，可分化成不規則形態或類圓形或梭形狀態的貼壁細胞，一般有偽足延伸。見圖1。

2.2泡沫細胞模型建立及鑒定 巨噬細胞由于吞噬了大量ox-LDL，會在胞內形成大量脂滴，細胞形態會相應增大，胞內脂滴會被著染形成紅色或橘紅色脂質累積點，即紅色顆粒斑點狀代表為脂滴；對照組在無ox-LDL加入共同孵育的情況下，胞內少見或未見明顯紅色脂滴累積；而在經過ox-LDL共同孵育48 h后的實驗組結果顯示，可見大量的紅色脂滴在細胞內蓄積。見圖2。

圖1 PMA刺激誘導24 h后不同倍鏡下巨噬細胞形態(油紅O染色)

圖2 無ox-LDL組和ox-LDL組分別在不同倍鏡下脂質蓄積情況(油紅O染色)

2.3MTT法檢測各組含藥血清對泡沫細胞增殖影響 隨著干預時間延長，各組吸光度(OD)值逐漸降低，48 h測得各組細胞OD值最低；益脈降脂湯含藥血清干預12 h、24 h和48 h后，與巨噬細胞組相比，同時間點模型組OD值顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，同時間點西藥組與中藥各劑量組的OD值均顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 各組含藥血清干預不同時間對巨噬細胞泡沫化 增殖活性的影響

2.4各組干預不同時間點細胞內TC含量比較 與巨噬細胞組相比，相同時間點模型組細胞內TC含量顯著增高(P<0.05)；與模型組相比，相同時間點西藥組與中藥各劑量組細胞內TC含量明顯降低(P<0.05)，見表2。

2.5油紅O染色觀察各組含藥血清對泡沫細胞脂質蓄積的影響 與模型組對比，巨噬細胞組胞內少見或未見明顯紅色脂滴累積；而在各組含藥血清干預后的泡沫細胞，在顯微鏡下仍均可見紅色脂滴在細胞內蓄積，但與模型組對比，西藥組和中藥各劑量組脂質蓄積明顯減少，見圖3。

表2 各組干預下同時間點細胞中TC水平 比較

圖3 各組細胞脂質蓄積(油紅O染色，×20)

2.6Image J Area(%)的半定量分析 與巨噬細胞組(3.095%)比較，模型組Area(%)(9.944%)明顯升高，與模型組比較，西藥組和中藥高、中、低各劑量組Area(%)(6.033%、6.819%、6.215%、7.494%)明顯降低(P<0.05)。

3 討 論

本研究根據前期研究和實踐經驗，通過應用中藥血清藥理學〔7～9〕藥方法，進一步探究益脈降脂湯含藥血清對泡沫細胞的脂質代謝的影響作用。美國心臟協會指出，易損性斑塊所包括的薄纖維帽狀AS，其特征是病變由一個小于65 μm厚的纖維帽覆蓋，其中就包含許多富含脂質的巨噬細胞泡沫細胞，巨噬細胞能合成和釋放多種生長因子和炎癥因子，還分泌多種基質金屬蛋白酶(MMPs)，削弱纖維帽并使其容易破裂。而當泡沫細胞凋亡壞死，會將細胞內大量的脂質釋放出來，積累形成脂核，導致不穩定易損斑塊的形成。因此，脂質浸潤特別是巨噬細胞泡沫化是AS斑塊具有不穩定易損斑塊的特征之一〔10〕，所以如何穩定斑塊也是眾多學者共同努力的方向。本研究發現，巨噬細胞在大量吞噬ox-LDL后，從形態上，細胞體形會相應增大，說明脂質蓄積在胞內蓄積，而當這種情況發生在易損斑塊，這無疑是會造成脂核的增大。因此本文希望通過在中藥含藥血清的干預下，在已經發生巨噬細胞泡沫化之后，能夠穩定泡沫細胞，使其減少細胞破裂而趨于相對穩定。通常根據測得OD值，來判斷活細胞數量，OD值越大，細胞活性越強〔11〕。由于巨噬細胞屬于高級分化的終末細胞，是一種非特異性免疫細胞，一般不具備增殖能力〔12〕，因此也更能反映泡沫細胞的活性情況。在加入含藥血清12、24、48 h后，細胞總體增殖活性即細胞存活率隨培養時間增長而OD值逐漸下降，這可能也與高濃度的ox-LDL刺激有關，加速了細胞凋亡〔13〕。這并非代表含藥血清對細胞的破壞作用，而是相對時間延長，細胞凋亡增加。本研究說明了ox-LDL誘導下的泡沫細胞并非在含藥血清的干預下實現細胞增殖，而是細胞存活能力相對提高，因此含藥血清各組細胞相對模型組細胞的死亡減少。提示西藥組和中藥各劑量組的含藥血清均能對泡沫細胞存活率具有促進作用，具有穩定泡沫細胞使其免于凋亡破裂而加重AS。

細胞內膽固醇含量是泡沫細胞脂質累積最直觀的評價指標〔14〕，檢測細胞內膽固醇含量水平也可從另外一個角度闡明益脈降脂湯含藥血清對巨噬細胞源性泡沫細胞脂質代謝影響的干預作用。事實上，許多中藥的有效成分如決明子總蒽醌、絞股藍皂苷、黃芪多糖丹參多酚等已被證實具有抗巨噬細胞泡沫化的作用〔15〕，而益脈降脂湯中諸如絞股藍、山楂、澤瀉等中藥更是具有明確的降脂效果。在AS發生過程中，動脈內膜可見脂質條紋和纖維樣斑塊，主要是由單核巨噬細胞吞噬膽固醇后的泡沫細胞構成。泡沫細胞的形成是以巨噬細胞內膽固醇酯的含量占TC含量的將近一半〔16〕。本研究結果提示泡沫細胞是終末細胞，細胞會隨時間延長而凋亡，因而細胞內脂質含量會隨時間增加而降低。同時說明了模型組內與模型組在吞噬大量ox-LDL之后，泡沫細胞內的脂質含量明顯增高；中藥各劑量組含藥血清均對泡沫細胞的脂質累積有明顯改善作用。

此外，本文也從形態學的角度直觀地觀察了不同組別含藥血清干預各組泡沫細胞48 h后油紅O染色情況，表明從細胞形態學上，經過各組含藥血清干預處理后，泡沫細胞的脂質蓄積情況明顯改善，與上述結果基本一致，從而進一步表明益脈降脂湯含藥血清可明顯改善泡沫細胞的脂質代謝。

綜上，益脈降脂湯含藥血清可能提高泡沫細胞生存活性，具有減少泡沫細胞凋亡、改善泡沫細胞膽固醇蓄積的作用，而益脈降脂湯的所發揮的抗AS作用機制仍需進一步探究。