基于MEK/ERK信號通路探究丹參酮ⅡA磺酸鈉對缺氧復氧心臟微血管內皮細胞的保護作用

李靜 盧峰 穆懷彬 李燕 (唐山市工人醫院心內科，河北 唐山 063000)

丹參酮ⅡA磺酸鈉(STS)是從丹參中提取的二萜醌類化合物，具有擴張血管、改善微循環、抗炎抗氧化等藥理作用，常用于治療心腦血管疾病〔1〕。心肌缺血/再灌注損傷是指心肌組織在急性缺血后恢復血流供應時，出現損傷加重現象〔2〕，內皮缺氧/復氧(H/R)是缺血-再灌注損傷的主要后果，它可以引發氧化應激，引起多種器官組織損傷，誘導細胞凋亡和內皮功能障礙〔3〕。本實驗通過建立心臟微血管內皮細胞(CMECs)H/R模型，觀察STS對CMECs的保護作用與機制。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級雄性SD大鼠30只，體重(180～220)g，購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗單位使用許可證號SCXK(魯)20190003。

1.2主要試劑 DMEM培養基(上海吉至生化科技有限公司)；胎牛血清(FBS，廣州柏賽柯生物技術有限公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒、β-actin單克隆抗體(上海恒斐生物科技有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)、RNaseA、碘化丙啶(PI)、胰酶、電化學(ECL)發光液(北京伊塔生物科技有限公司)；膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/PI細胞凋亡檢測試劑盒(上海經科化學科技有限公司)；酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3多克隆抗體、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關X蛋白(Bax)多克隆抗體(武漢亞科因生物技術有限公司)；p-促分裂原活化蛋白激酶(MEK)單克隆抗體(上海鈺博生物科技有限公司)；p-細胞外信號調節激酶(ERK)1/2(上海翔升生物科技有限公司)；基質膠(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1CMECs的分離與培養 出生4 d以內的SD大鼠，全身用75%乙醇進行2次全身消毒后，仰臥位固定于超凈臺中的操作臺上。開胸取心室肌，在37℃的條件下用眼科剪剪碎，并在0.1%的胰蛋白酶消化2～3次，每次消化5 min。隨后在4℃、1 000 r/min條件下離心10 min，棄上清，內皮細胞重懸于含10% FBS DMEM培養基進行鑒定及傳代培養，傳代4次后用于后續實驗。

1.3.2CMECs細胞H/R模型的建立及實驗分組 用缺氧液潤洗離體培養的細胞3次(缺氧液預先用高純氮氣飽和30 min)，根據培養皿大小換用不同體積的缺氧液，在1%O2、 5%CO2、95%N2，37℃條件下制作缺氧模型，復氧實驗時立即換用正常培養基置于細胞培養箱(5%CO2、95%空氣、37℃)條件下培養，制作H/R模型〔4〕。實驗分組為對照組：除正常培養外不做其他處理；H/R組：構建的H/R模型細胞；低劑量STS組：除培養基外加入12.5 μg/ml STS；中劑量STS組：除培養基外加入25.0 μg/ml STS；高劑量STS組：除培養基外加入50.0 μg/ml STS。

1.3.3MTT比色法檢測CMECs細胞活力 CMECs細胞以2 000個/孔的密度接種于96孔培養板，給予相應處理后，繼續培養96 h后，每組做3個復孔。向每孔加入MTT 10 μl(5 mg/ml)，37℃孵育4 h后，去除培養基，并加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl。將96孔培養板置于酶標儀上讀數，設置波長490 nm，記錄數據〔5〕。

1.3.4流式細胞術檢測細胞凋亡率 通過Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測每組細胞的凋亡率。將細胞用0.25%胰酶消化，5 min后吸出消化液，用預冷的PBS洗滌，轉移至離心管，離心(1 000 r/min，5 min)后棄去上清。用PBS重懸細胞，調整細胞濃度為1×106個/ml。隨后加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl PI至100 μl的細胞懸液中。在室溫下避光孵育5～15 min，然后使用流式細胞儀檢測，膠質瘤細胞核呈現紅色熒光，即細胞呈晚期凋亡現象〔6〕〔細胞凋亡率(%)=凋亡細胞數/細胞總數×100%〕。

1.3.5Western印跡 吸出細胞培養液，PBS清洗3次，6孔板每孔中加120 μl放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液，置于冰上裂解20 min，將細胞裂解物收集到離心管中，離心提取上清液，即為細胞總蛋白。蛋白經沸水變性后冷卻至常溫，在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結束后進行轉膜，使用聚偏氟乙烯(PVDF)膜恒流轉膜2 h；將轉膜完畢的PVDF膜取出，浸泡于5%脫脂奶粉配制的封閉液中，37℃封閉1 h后洗膜。洗膜后，分別加Bax多克隆抗體、酶切caspase-3多克隆抗體、p-MEK多克隆抗體、p-ERK2多克隆抗體，一抗稀釋比例為1∶1 000，4℃孵育過夜；回收一抗，洗滌后加入適量的二抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h。滴加適量的ECL底物液，孵育數分鐘，使用凝膠圖像分析系統觀察〔7〕。

1.3.6流式細胞術檢測細胞周期 取處于對數生長期的細胞，用胰酶消化，消化4 min后吸出消化液，離心(1 000 r/min，5 min)后棄去上清，加入PBS輕輕吹打重懸，使用移液槍將細胞懸液轉至流式管內，離心棄去上清；用PBS洗滌3次，用事先-20℃預冷的75%乙醇1 ml重懸細胞，封閉流式管口，-20℃保存過夜。加入PBS洗滌1遍，離心(1 000 r/min，5 min)后棄去上清；加入100 μl的RNaseA，37℃水浴30 min，加入400 μl的PI溶液并充分混勻，4℃避光孵育30 min，用流式細胞儀檢測，保存數據〔8〕。

1.3.7光學顯微鏡下觀測CMECs細胞血管形成能力 提前1 d把基質膠置于冰上4℃融化。在無菌條件下，將200 μl基質膠迅速鋪到-20℃預冷的6孔板中，使基質膠均勻鋪滿整個板孔，確保膠完全覆蓋孔底，并且無氣泡，將其放入細胞培養箱中至凝固后待用。消化收集細胞，取2×105個細胞均勻接種到有基質膠的6孔板中，繼續培養24 h。在光學顯微鏡下觀察CMECs血管形成情況〔9〕。血管形成率=(血管形成后的細胞數量-血管形成前的細胞數量)/血管形成前的細胞數量×100%。

1.4統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗及單因素方差分析。

2 結 果

2.1STS對CMECs細胞活力的影響 與對照組相比，H/R組細胞活力顯著降低(P<0.05)；與H/R組比較，低、中、高劑量STS組細胞活力均顯著增高，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見表1。表明STS可增加H/R誘導后CMECs細胞活力。

表1 STS對CMECs細胞活力、凋亡及細胞周期的影響

2.2STS對CMECs細胞凋亡的影響 與對照組相比，H/R組細胞凋亡率、Bax、酶切caspase-3水平顯著升高(P<0.05)；與H/R組比較，低、中、高劑量STS組細胞凋亡率、Bax、酶切caspase-3水平均顯著降低，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見表1、圖1、圖2。表明STS可抑制H/R誘導的CMECs細胞凋亡。

2.3STS對CMECs細胞周期進程的影響 與對照組比較，H/R組G0/G1期比例明顯升高(P<0.05)，S期明顯降低(P<0.05)，提示，細胞周期被阻滯在G0/G1期。與H/R組比較，低、中、高劑量STS組細胞G0/G1期比例依次降低，S期依次升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，G2/M期細胞數占總細胞數的百分比變化不大，表明STS處理后G0/G1期向S期轉變，阻滯解除。見表1、圖3。

2.4STS對CMECs細胞血管形成能力的影響 與對照組相比，H/R組管的形成顯著降低(P<0.05)；與H/R組比較，低、中、高劑量STS組管的形成均顯著升高，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見圖4、表2。表明STS可促進H/R誘導的血管形成能力。

1～5:對照組，H/R組，低劑量STS組，中劑量STS組，高劑量STS組，圖5同圖1 Western印跡檢測Bax、酶切caspase-3水平

圖2 STS對CMECs細胞凋亡的影響

圖3 STS對CMECs細胞周期的影響

圖4 STS對CMECs細胞血管形成能力的影響(×200)

2.5STS對MEK/ERK信號通路相關蛋白表達的影響 與對照組相比，H/R組p-MEK、p-ERK2水平顯著降低(P<0.05)；與H/R組比較，低、中、高劑量STS組p-MEK、p-ERK2水平均顯著升高，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見表2、圖5。表明STS可通過激活MEK/ERK信號通路抑制H/R誘導的細胞凋亡和血管形成能力。

表2 STS對CMECs細胞血管形成能力及MEK/ERK 信號通路相關蛋白表達的影響

圖5 STS對MEK/ERK信號通路相關蛋白表達的影響

3 討 論

MEK/ERK信號通路是多種細胞因子調控細胞凋亡和增殖的關鍵，MEK/ERK信號通路是血管生成最為重要的信號轉導，MEK/ERK信號通路的激活能夠促進正常內皮血管的生成，改善血管內皮功能〔10〕。ERK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中重要的成員之一。其中ERK能夠被上游分子MEK的磷酸化激活，進入細胞核，作用于相應的轉錄因子及核蛋白，參與血管的調控，發揮調節細胞增殖、凋亡和分化等作用〔11〕。caspase-3、Bax蛋白與細胞凋亡密切相關，是介導細胞凋亡的重要調控因子，可反映細胞凋亡狀態〔12〕。本研究結果提示STS使MEK/ERK信號被激活，凋亡受到抑制。這與前人研究〔13〕發現的MEK/ERK信號通路的激活可保護人CMECs免受H/R誘導的損傷一致。

細胞周期是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程，分為分裂間期與分裂期2個階段，并嚴格按照G0/G1期、S期、G2期、M期的順序進行〔14〕。ERK信號通路在血管內皮細胞增殖及新血管生成過程中發揮重要作用，持續性激活的ERK信號通路可正向調控細胞周期，推動細胞由G1期進入S期，進而促進細胞異常增殖與分化。本研究結果說明STS可以促進CMECs細胞周期進展，增強血管形成能力。

綜上，STS對H/R CMECs損傷的保護作用與其激活MEK/ERK信號通路有關。