LINC00342靶向miR-384對腎癌細胞生物學行為的影響

劉華 馮玉 楊靜 張瑞城

(1海口市第四人民醫院腎內科，海南 海口 571100；2海南醫學院第一附屬醫院腎內科)

腎癌是臨床常見的一種泌尿系統惡性腫瘤，臨床主要采用手術治療腎癌，但患者預后較差〔1，2〕。目前腎癌發病機制尚未闡明，因而尋找影響腎癌細胞增殖、遷移及侵襲等生物學行為的基因有助于提高腎癌治療效果及改善患者預后。研究表明一些長鏈非編碼RNA(LncRNA)可調控腎癌細胞增殖及侵襲等生物學行為〔3，4〕。LncRNA LINC00342在非小細胞肺癌中表達上調，并可促進腫瘤細胞生長及轉移〔5〕。但LINC00342在腎癌發生及發展過程中的作用機制尚未可知。研究表明LncRNA對微小RNA(miRNA)具有海綿吸附作用，LncRNA通過競爭性結合miRNA并抑制miRNA表達參與腫瘤發展過程〔6〕。生物信息學分析顯示LINC00342與miR-384可能存在靶向調控關系，研究表明miR-384可抑制腎癌細胞生長及侵襲〔7〕。但LINC00342是否通過調控miR-384表影響腎癌進展尚未可知。本研究主要探討LINC00342在腎癌中的表達及其對腎癌細胞惡性生物行為的影響，并探究其對miR-384的作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 腎癌786-O細胞購自上海匹拓生物科技有限公司；杜氏改良培養基(DMEM)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；0.25%胰蛋白酶購自廣州市達暉生物技術有限公司；LINC00342小干擾RNA(si-LINC00342)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-384模擬物(mimics)及陰性對照(miR-NC)、miR-384特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-384)及其陰性對照(anti-miR-NC)均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；pcDNA3.1購自上海北諾生物科技有限公司；Trizol、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)、細胞凋亡檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell小室、基質膠購自上海宇進生物科技有限公司；放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液購自北京全式金生物技術有限公司；兔抗人B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體購自合肥康源生物科技研究所；兔抗人P21抗體購自美國CST公司；兔抗人基質金屬蛋白酶(MMP)-2、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體購自武漢菲恩生物科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自北京博爾西科技有限公司。

腎癌組織與癌旁組織標本來源：收集2017年6月至2018年3月海口市第四人民醫院收治的33例腎癌患者，男20例，女13例，平均年齡(56.57±9.48)歲，所有患者經病理證實為腎癌，術前均未接受化療或放療。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者知情且簽署同意書。

1.2方法

1.2.1細胞轉染及實驗分組 采用DMEM培養基常規培養腎癌786-O細胞，待細胞融合度達到70%時進行傳代培養。將si-NC、si-LINC0034轉染至786-O細胞，記為si-NC組、si-LINC00342組；將si-LINC0034分別與anti-miR-NC、anti-miR-384共轉染至786-O細胞，記為si-LINC00342+anti-miR-NC組、si-LINC00342+anti-miR-384組。

1.2.2實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測LINC00342、miR-384的表達水平 提取腎癌組織、癌旁組織及各組786-O細胞總RNA，取2 μg RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR反應，LINC00342以GAPDH為內參，miR-384以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算LINC00342、miR-384相對表達量。

1.2.3MTT比色法檢測細胞增殖抑制率 收集各組786-O細胞，按試劑盒說明操作，酶標儀檢測490 nm處相對吸光度值(OD)，計算細胞增殖抑制率〔(空白組-實驗組)/空白組×100%〕。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組786-O細胞，按試劑盒說明操作，置于FACS Calibur流式細胞儀及應用Cellauest軟件檢測各組細胞凋亡。

1.2.5Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲 遷移：收集各組對786-O細胞，取200 μl細胞懸液加入Transwell小室上室，下室加600 μl含血清培養液，培養24 h，依次采用多聚甲醛固定(20 min)與0.1%結晶紫染液染色(10 min)，擦拭未遷移細胞，顯微鏡(200倍)下觀察計數。侵襲：稀釋基質膠，取40 μl稀釋液加入Transwell小室上室，然后按遷移操作進行。

1.2.6雙熒光素酶報告基因檢測LINC00342與miR-384的靶向關系 StarBase預測顯示miR-384可能是LINC00342的靶基因，構建野生型和突變型報告基因載體WT-LINC00342和MUT-LINC00342，將其分別與miR-NC、miR-384共轉染至786-O細胞，培養48 h后檢測各組相對熒光素酶活性。為探討LINC00342對miR-384表達水平的影響，將786-O細胞隨機分成4組：pcDNA3.1組、pcDNA3.1-LINC00342組、si-NC組、si-LINC00342組，通過qRT-PCR檢測miR-384表達水平。

1.2.7Western印跡檢測Bcl-2、P21、Bax、MMP-2、E-cadherin蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，沸水煮10 min變性；進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，80 V 30 min，120 V 90 min)；電泳結束后轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃條件下孵育蛋白一抗稀釋液，24 h后加入二抗稀釋液，室溫孵育1 h，曝光，顯影，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1LINC00342在腎癌組織和癌旁組織中的表達 腎癌組織中LINC00342的表達水平(2.14±0.23)顯著高于癌旁組織(1.01±0.13,P<0.05)。

2.2抑制LINC00342對786-O細胞增殖、凋亡的影響 si-LINC00342組786-O細胞中LINC00342的表達水平顯著低于si-NC組(P<0.001)，提示成功降低786-O細胞中LINC00342的表達。與si-NC組相比，si-LINC00342組786-O細胞增殖抑制率和凋亡率顯著升高，P21、Bax蛋白表達量顯著升高，Bcl-2蛋白表達量顯著降低(均P<0.001)，見表1、圖1、圖2。

表1 抑制LINC00342對786-O細胞增殖、凋亡的影響

圖1 抑制LINC00342對786-O細胞凋亡的影響

圖2 抑制LINC00342對細胞786-O增殖、凋亡 蛋白表達的影響

2.3抑制LINC00342對786-O細胞遷移、侵襲的影響 相較于si-NC組，si-LINC00342組遷移與侵襲細胞數均顯著減少，MMP-2蛋白表達量顯著降低，E-cadherin蛋白表達量顯著升高(均P<0.001)，見表2、圖3、圖4。

表2 抑制LINC00342對細胞786-O遷移、侵襲的 影響

圖3 786-O細胞遷移、侵襲(結晶紫，×200)

圖4 Western印跡檢測遷移、侵襲相關蛋白的表達

2.4LINC00342靶向、調控miR-384 StarBase預測顯示LINC00342與miR-384有互補的核苷酸序列，見圖5。WT-LINC00342與miR-384共轉染的786-O細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.001)，見表3。pcDNA3.1-LINC00342組miR-384表達水平(0.26±0.03)顯著低于pcDNA3.1組(0.99±0.09，P<0.05)；與si-LINC00342組miR-384表達水平(2.04±0.21)顯著高于si-NC組(0.98±0.08，P<0.05)。

圖5 LINC00342靶向miR-384

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.5抑制miR-384能逆轉抑制LINC00342對786-O細胞增殖、凋亡的影響 si-LINC00342+anti-miR-384組786-O細胞中miR-384的表達水平顯著低于si-LINC00342+anti-miR-NC組(P<0.001)。提示成功降低786-O細胞中miR-384的表達。與si-LINC00342+anti-miR-NC組相比，si-LINC00342+anti-miR-384組786-O細胞增殖抑制率和凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白表達量顯著升高，P21、Bax蛋白表達量降低(均P<0.001)，見圖6、圖7、表4。

圖6 抑制miR-384能逆轉抑制LINC00342對786-O 細胞增殖、凋亡的影響

1，2:si-LINC00342+anti-miR-NC組、si-LINC00342+anti-miR-384組，圖9同圖7 抑制miR-384能逆轉抑制LINC00342對786-O 細胞增殖、凋亡蛋白表達的影響

表4 抑制miR-384能逆轉抑制LINC00342對786-O細胞增殖、凋亡的影響

2.6抑制miR-384能逆轉抑制LINC00342對786-O細胞遷移、侵襲的影響 與si-LINC00342+anti-miR-NC組比較，si-LINC00342+anti-miR-384組遷移與侵襲細胞數顯著增多，MMP-2蛋白表達量顯著升高，E-cadherin蛋白表達量顯著降低(均P<0.001)，見表5、圖8、圖9。

表5 抑制miR-384能逆轉抑制LINC00342對細胞786-O 遷移、侵襲的影響

圖8 抑制miR-384能逆轉抑制LINC00342對786-O 細胞遷移、侵襲的影響(結晶紫，×200)

圖9 抑制miR-384能逆轉抑制LINC00342對786-O 細胞遷移、侵襲蛋白表達的影響

3 討 論

LncRNA在腎癌轉移過程中發揮重要調控作用，下調或上調LncRNA可影響腎癌細胞增殖、遷移及侵襲等生物學行為〔8～10〕。LINC00342高表達量可促進嬰兒血管瘤的生長〔11〕。研究表明LINC00342在非小細胞肺癌中呈高表達并可作為患者預后不良的重要標志物〔12，13〕。本研究結果提示LINC00342表達量升高可能促進腎癌的發生。本研究結果提示抑制LINC00342可抑制腎癌細胞增殖，促進細胞凋亡。研究表明P21蛋白表達水平升高可抑制腎癌細胞生長，誘導細胞周期阻滯〔14〕。Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，Bax屬于抗凋亡蛋白，研究表明腎癌細胞中Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高并可促進細胞凋亡〔15〕。本研究結果提示抑制LINC00342表達可能通過調控相關蛋白表達從而抑制腎癌細胞增殖，誘導細胞凋亡。研究表明MMP-2可通過降解細胞外基質而促進腫瘤細胞擴散及轉移，同時上皮-間質轉化(EMT)可促進腫瘤浸潤及轉移，EMT上皮型標志物E-cadherin表達下調可增強遷移及侵襲能力〔16〕。本研究結果提示抑制LINC00342表達可抑制腎癌細胞遷移及侵襲。

LncRNA TSIX可通過充當miR-384的海綿分子從而促進胰腺癌增殖〔17〕。研究表明miR-384可分別通過靶向負調控Smad核內相關蛋白(SNIP)1、多效生長因子(PTN)的表達從而抑制腫瘤細胞進展〔18，19〕。相關報道指出miR-384通過靶向AKT3抑制大腸癌細胞增殖〔20〕。本研究證實LINC00342可靶向結合并負向調控miR-384的表達，抑制miR-384表達聯合抑制LINC00342表達可明顯降低腎癌細胞增殖抑制率及細胞凋亡率，減弱細胞遷移及侵襲能力。提示抑制LINC00342表達可能通過上調miR-384表達而減弱腎癌細胞的惡性生物學行為。