食管癌移植瘤小鼠模型建立

耿園園 賈祥磊 劉玉珍 齊博 秦秀廣 劉尚國(guó) 趙寶生

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 1食管癌研究所，河南 衛(wèi)輝 453100；2第一附屬醫(yī)院胸外科；3生命科學(xué)研究中心)

目前食管癌(EC)研究模型主要集中于細(xì)胞系構(gòu)建的裸鼠模型，但該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ腿狈δ[瘤異質(zhì)性，不能較為真實(shí)地反映不同病人的情況〔1，2〕。而近幾十年發(fā)展起來(lái)的患者來(lái)源的移植瘤(PDX)模型可有效地解決這一弊端，構(gòu)建較為理想的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?，4〕，為新藥研發(fā)和臨床個(gè)性化治療提供了一種新的治療策略。但是目前PDX模型多選用超重度免疫缺陷(NOG)小鼠〔5，6〕，該類小鼠易感染病菌死亡，另外價(jià)格較高。本研究旨在將PDX模型負(fù)載小鼠由NOG小鼠轉(zhuǎn)移到免疫缺陷程度較低的BALB/c Nude裸鼠上，降低PDX模型成本。

1 材料與方法

1.1病人和組織樣本 本研究已經(jīng)獲得新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，依據(jù)赫爾辛基宣言，在手術(shù)前，與患者協(xié)商一致，患者或家屬簽署了知情同意書(shū)。所有組織樣本由醫(yī)院病理科確診為EC。

1.2方法

1.2.1樣本的收集與處理 收集13例EC患者手術(shù)切除的EC組織。提前在手術(shù)室等候，當(dāng)醫(yī)生手術(shù)切下EC組織后，迅速用適量的營(yíng)養(yǎng)液(80% RPMI1640培養(yǎng)基+10%雙抗+10 μg/ml兩性霉素B)儲(chǔ)存，置于冰盒中，迅速帶到實(shí)驗(yàn)室中。在無(wú)菌操作臺(tái)中，再用冷洗液〔90%磷酸鹽緩沖液(PBS)+10%雙抗+10 μg/ml兩性霉素B〕清洗組織3次，并把腫瘤組織切成大小為1 mm×1 mm×1 mm的小塊。以上所有操作在冰上進(jìn)行。

1.2.2PDX小鼠模型的建立 異氟烷麻醉NOG小鼠，待小鼠麻醉后，將上述切成小塊的EC組織用無(wú)菌鑷子和剪刀接種至小鼠背后皮下。再用無(wú)菌的縫合針和縫合線縫合小鼠創(chuàng)口，用碘伏消毒縫合好的創(chuàng)口。用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，計(jì)算腫瘤體積(體積=1/2×長(zhǎng)徑×短徑2)，每周測(cè)2次。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到750 mm3或以上時(shí)，處死小鼠。將腫瘤組織分為3份，1份用4%的中性甲醛固定，1份用于下一代PDX模型小鼠皮下接種，另1份液氮凍存。

1.2.3蘇木素-伊紅(HE)染色 組織樣本均用4%中性甲醛固定24 h以上，常規(guī)石蠟包埋，3 μm連續(xù)切片；脫蠟處理：二甲苯(Ⅰ)10 min，二甲苯(Ⅱ)10 min；復(fù)水：100%乙醇3 min，95%乙醇3 min，80%乙醇3 min，60%乙醇3 min，自來(lái)水浸泡5 min；HE染色：蘇木素染色2 min，伊紅10 s。HE染色片子由兩位獨(dú)立的病理科醫(yī)生判斷標(biāo)本。

1.2.4PDX樣本庫(kù)建立 將解剖下來(lái)的小鼠腫瘤組織用無(wú)菌冷洗液(90% PBS+10%雙抗+10 μg/ml兩性霉素B)清洗組織3次，去除壞死部分。再把組織剪成體積5 mm×2 mm×2 mm的小塊，放入含有1.5 ml凍存液〔60% RPMI1640培養(yǎng)基+30%胎牛血清(FBS)+10%二甲基亞砜(DMSO)〕的凍存管中。置于-80℃冰箱中，利用凍存盒進(jìn)行梯度降溫，24～48 h后，轉(zhuǎn)入液氮中長(zhǎng)期保存待用。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1PDX模型的建立及患者臨床特點(diǎn) P1代NOG小鼠成瘤5例(38.5%)，未成瘤8例(61.5%)，P1代成瘤的5例繼續(xù)接種至P2代，P2代NOG小鼠成瘤4例(80.0%)，未成瘤1例(20.0%)，P3代以后成瘤率為100.0%。在接種P3代NOG小鼠時(shí)，同時(shí)接種在裸鼠皮下。P3代以后裸鼠全部成瘤，PDX成功率為100.0%。

表1為成瘤小鼠所對(duì)應(yīng)的病人病理信息，可以看出食管鱗狀細(xì)胞癌病人的分化程度越高，PDX模型小鼠越容易成瘤。

表1 PDX成瘤模型病人相關(guān)信息

2.2PDX小鼠模型和EC病人腫瘤組織HE比較 圖1食管鱗狀細(xì)胞癌(EC5、EC8和EC9)和小細(xì)胞EC(EC7)的P1和P2代，與相對(duì)應(yīng)的病人組織P0代相比，切片HE染色組織結(jié)構(gòu)類似。

圖1 EC患者腫瘤組織 HE 染色(×400)

2.3各代成瘤時(shí)間比較 P1和P2成瘤時(shí)間(61.00 d vs 51.75 d，P=0.675)、P2和P3成瘤時(shí)間(41.67 d，P=0.416)、P3和P4成瘤時(shí)間(46.67 d，P=0.770)比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各組間成瘤時(shí)間并未隨著代數(shù)增加而縮短。

2.4NOG小鼠和裸鼠荷瘤情況比較 圖2左側(cè)為NOG小鼠和裸鼠在體荷瘤情況，發(fā)現(xiàn)NOG小鼠較裸鼠荷瘤更規(guī)則、緊實(shí)。圖2右側(cè)自左至右依次是EC5、EC7、EC8和EC9小鼠處死后剝離的腫瘤，其中EC5、EC8和EC9小鼠是食管鱗狀細(xì)胞癌患者來(lái)源，EC7為小細(xì)胞EC來(lái)源。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞EC來(lái)源的EC7腫瘤較食管鱗狀細(xì)胞癌血供更豐富。這可能是小細(xì)胞EC病人發(fā)病迅速，術(shù)后生存期短的重要原因。

圖2 PDX小鼠模型荷瘤情況

3 討 論

腫瘤組織是由腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等組成〔7〕。而腫瘤細(xì)胞系成瘤缺乏異質(zhì)性，難以反映出腫瘤病人的真實(shí)情況〔8，9〕。而PDX模型來(lái)源于臨床病人腫瘤組織，該組織含有病人的原始的腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等。因而，PDX模型可以更真實(shí)地反映腫瘤病人情況〔10〕。

目前PDX模型小鼠一般都接種到NOG小鼠上〔11〕，但是NOG小鼠成本較高，另外也對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境要求較高，易發(fā)生意外死亡現(xiàn)象(荷瘤小鼠飼養(yǎng)周期較長(zhǎng))。因此，本研究在P3代將P2代小鼠的腫瘤組織移植到裸鼠上，結(jié)果提示PDX模型可以先接種在NOG小鼠上，在P3代時(shí)，可以成批量接種到成本較低的裸鼠上。

與相關(guān)文獻(xiàn)相比〔2〕，本實(shí)驗(yàn)里同一病人組織來(lái)源的各代荷瘤小鼠腫瘤，達(dá)到取瘤標(biāo)準(zhǔn)(腫瘤體積≥750 mm3)的時(shí)間并不具有隨著接種代數(shù)增加而逐漸縮短的趨勢(shì)。這可能是由于各代小鼠接種相同大小和數(shù)量的腫瘤組織，而分割的成小塊腫瘤組織含有不同比例的結(jié)締組織等非腫瘤組織。因此，這就可能使各代小鼠隨機(jī)接種的腫瘤組織量不一樣，從而導(dǎo)致成瘤時(shí)間不隨著代數(shù)增加而縮短。

在荷瘤小鼠培養(yǎng)過(guò)程中，出現(xiàn)4只小鼠意外死亡，尤其是EC6在腫瘤體積(V=680 mm3)即將達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)成瘤體積前意外死亡，導(dǎo)致成瘤率偏低。由于NOG小鼠缺少B細(xì)胞免疫、T細(xì)胞免疫和天然免疫〔9〕，在較長(zhǎng)期得飼養(yǎng)過(guò)程中，容易滋生病菌，造成小鼠感染死亡。因此，對(duì)于NOG小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境要特別注意消毒滅菌，避免因小鼠意外死亡而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

目前EC的治療方式主要是手術(shù)、放化療〔12〕。但是患者化療極易出現(xiàn)耐藥情況〔13〕，臨床上為追求對(duì)EC病人更好的治療效果，經(jīng)常會(huì)結(jié)合物理放療治療，我們后續(xù)也會(huì)化療聯(lián)合放療，對(duì)其與病人治療效果進(jìn)行一致性研究。

本文成功將PDX模型負(fù)載小鼠由NOG轉(zhuǎn)移到裸鼠上，降低了PDX模型造模過(guò)程中NOG小鼠意外死亡，并降低了PDX模型實(shí)驗(yàn)成本。