基于PI3K/Akt信號通路探討雄性激素對慢性心力衰竭心肌細胞凋亡的影響

胡陽 鄧潔 王婷婷 姜華 羅勇 楊永麗 蘇慧鵬 王煜

(昆明醫科大學附屬延安醫院 1老年病科，云南 昆明 650000；2消化科；3云南省楚雄州武定縣人民醫院心內科)

慢性心力衰竭(CHF)是各種心血管疾病發展的最終階段，由于心肌收縮力減退，致前向血流減少和肺靜脈系統血流回流障礙，而交感神經系統及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS) 的激活起代償作用。RAAS在心室重塑、心力衰竭(HF)的發展過程中起到重要作用。近年研究發現CHF時雄激素水平降低，雄激素水平下降又加重心功能不全。CHF患者雄激素水平降低,其可能參與了HF的病理生理過程。雄激素補充治療有可能通過激活磷脂酰激酶-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路改善心血管功能、增加運動強度與時間、抑制導致CHF進程的神經激素。本研究探討雄激素對CHF大鼠心功能的影響。

1 材料與方法

1.1材料和試劑 成年雄性SD大鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(許可證號：SCXK(湘)2016-0002)。PI3K/Akt阻斷劑(LY294002)購自Selleck公司。鹽酸阿霉素(ADR)購自山西普德藥業有限公司(國藥準字H14023143)。丙酸睪酮(T)購自寧波第二激素廠(獸藥字(2016)110251054)。p-Akt抗體購自CST公司(貨號：9271)。Akt抗體購自CST公司(貨號：9272)。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體購自CST公司(貨號：9662)。TUNEL試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司(貨號：C1082)。主要設備：MindrayM7便攜彩超診斷儀。

1.2CHF模型建立 成年雄性SD大鼠55只，體重220～250 g，8月齡以上，隨機分為對照(Control)組(10只)、CHF組(15只)、T+CHF組(15只)、LY294002+T+CHF組(15只)。CHF采用腹腔注射ADR，第2天、第4天ADR 1 mg/kg；第6天、第8天ADR 2 mg/kg；第10、第12天ADR 3 mg/kg；第14、第16天ADR 4 mg/kg。T干預是在開始注射ADR同時經過皮下注射丙酸T，每次劑量為2 mg/kg,每2 d 1次，共15次,累積劑量達30 mg/kg。抑制組建模：LY294002干預是在開始注射ADR同時每天腹腔注射LY294002 50 mg/kg。而Control組和CHF組皮下注射相等體積的花生油及腹腔注射相等體積的生理鹽水。

1.3CHF模型的評估鑒定 ADR給藥30 d后使用MindrayM7便攜彩超診斷系統行超聲心動檢測。異氟烷吸入麻醉大鼠，心前區備皮，仰臥位固定。檢測評估大鼠左心室舒張末期內徑(LVDd)、左心室收縮期內徑(LVDs)、室間隔厚度(IVS)、心率(HR)、心臟射血分數(EF)，所有超聲測量值取3個心動周期的平均值。

1.4測定血清雄激素水平 于ADR給藥30 d后，用10%的水合氯醛腹腔麻醉后，采用20 μl的毛細管對大鼠進行眼內眥靜脈叢采血,收集靜脈血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內,4℃冰箱放置30 min,3 000 r/min離心15 min,吸取血漿,分裝后置于-80℃,采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血漿中雄激素含量。具體步驟參照試劑盒說明書。

1.5TUNEL法測定心肌細胞凋亡指數 于ADR給藥30 d后，用10%的水合氯醛腹腔麻醉后處死，用4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)將心臟中血液沖洗干凈，在-80℃冷凍2 h。用冰凍切儀切成6 μm切片，切片應用TUNEL凋亡檢測試劑盒進行檢測，使用末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)對凋亡細胞的DNA進行標記，通過辣根過氧化物酶(HRP)標記的鏈霉親和素檢測試劑對TdT標記，用二氨基聯苯胺(DAB)顯色。并且光鏡下觀察，凋亡細胞陽性呈現棕黃色染色，正常為藍色。采用Image-ProPlus6.0軟件計數凋亡心肌細胞數和心肌細胞總數，并計算凋亡指數。凋亡指數=凋亡細胞數/心肌細胞總數×100%。

1.6Western印跡檢測Caspase-3、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達 為了探討PI3K/Akt通路是否為雄激素改善心功能通路之一，本研究采用抑制劑LY294002對PI3K/Akt信號通路進行阻斷及補充雄激素。于ADR給藥30 d后，用10%的水合氯醛腹腔麻醉后，用4℃ PBS將心臟中血液沖洗干凈，取心肌組織，使用組織勻漿器及RIPA裂解液提取心肌組織蛋白，使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對提取的蛋白進行電泳，并使用聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉，按照不同分子量切取蛋白條帶按照對應蛋白孵育一抗，使用山羊抗小鼠和山羊抗兔的二抗按照一抗來源不同孵育二抗，采用電化學發光(ECL)底物進行顯色反應，用Image J 軟件進行灰度分析。

1.7免疫組化檢測心肌組織中Caspase-3、p-PI3K、p-Akt 蛋白的表達 為進一步驗證雄激素改善心功能通過激活PI3K/Akt通路減少心肌細胞凋亡，本研究將1.5步驟中冰凍切片通過3%H2O2去除內源性的過氧化氫酶，使用羊血清對切片進行封閉，分別按照Caspase-3(1∶100)、p-PI3K (1∶200)、p-Akt(1∶100)的一抗進行孵育，使用免疫組化通用二抗試劑盒孵育，用DAB進行顯色，使用蘇木素復染、梯度酒精常規脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察Caspase-3、p-PI3K、p-Akt蛋白表達情況，采用Image-ProPlus6.0軟件分析蛋白的表達情況。

1.8統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、LSD法，統計圖用GraphPad Prism6.0 軟件繪制。

2 結 果

2.1模型制作存活率 55只SD大鼠建模中死亡12只，分別為CHF組5只，T+CHF組3只，LY294002+T+CHF組4只，存活率為78.2%。

2.2各組心功能比較 與Control組比較，其余3組LVDd、LVDs明顯增大，EF明顯降低(P<0.05)。與CHF組比較，T+CHF組LVDd、LVDs、EF無統計學差異(P>0.05)，而HR明顯減慢(P<0.05)。與T+CHF組比較，LY294002+T+CHF組LVDd、LVDs無統計學差異(P>0.05)，而HR明顯加快，EF明顯降低(P<0.05)。各組IVS組間差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 ADR干預30 d各組心功能改變

2.3各組血清雄激素水平比較 與Control組〔(0.462±0.029)ng/ml〕比較，CHF組T水平〔(0.367±0.027)ng/ml〕明顯降低(P<0.05)；與CHF組比較，T+CHF和LY294002+T+CHF組血清T水平〔(0.519±0.018)、(0.528±0.068)ng/ml〕明顯升高(P<0.05)。

2.4TUNEL法測定CHF大鼠心肌細胞凋亡 ADR干預各組心肌細胞內可見較多棕色細胞核碎裂顆粒，提示心肌細胞發生凋亡，見圖1。CHF組TUNEL陽性細胞數〔(33.835±5.819)個〕、Caspase-3蛋白表達(0.993±0.058)明顯高于Control組〔(17.204±3.825)個、0.305±0.011；P<0.05〕；T+CHF組TUNEL陽性細胞數〔(20.235±8.172)個〕、Caspase-3蛋白表達(0.505±0.010)較CHF組明顯改善(P<0.05)；LY294002+T+CHF組TUNEL陽性細胞數〔(30.125±4.314)個〕、Caspase-3蛋白表達(0.696±0.052)明顯高于T+CHF組(P<0.05)，與CHF組無明顯差異(P>0.05)。見圖2。提示補充雄激素減輕CHF大鼠的心肌細胞凋亡，且減輕心肌細胞凋亡的途徑與LY294002抑制的信號通路有關。

圖1 TUNEL法檢測各組心肌凋亡細胞(HE染色，×400)

1～4：Control組,CHF組,T+CHF組,LY294002+T+CHF組圖2 Western印跡檢測各組Caspase-3、 p-Akt、p-PI3K/Akt蛋白表達

2.5LY294002對PI3K/Akt信號通路阻斷檢測 與Control組p-Akt/Akt及p-PI3K/Akt蛋白表達(1.604±0.053、0.692±0.019)比較，CHF組(0.801±0.024、0.410±0.015)、T+CHF組(1.266±0.020、0.503±0.000)、L294002+T+CHF組(0.216±0.017、0.210±0.006)均明顯降低(均P<0.05)；與CHF組比較，T+CHF組明顯上升(P<0.05)；與T+CHF組比較，LY294002+CHF組明顯降低(P<0.05)，見圖2。表明LY294002抑制劑可以在心肌中抑PI3K/Akt通路，同時說明雄激素可以激活PI3K/Akt通路。

2.6免疫組化檢測心肌組織中p-Akt、p-PI3K、Caspase-3蛋白表達水平 LY294002抑制劑加入后p-AKT、p-PI3K蛋白表達降低而Caspase-3蛋白表達升高，補充雄激素后p-Akt、p-PI3K蛋白表達升高而Caspase-3蛋白表達下降。見圖3。進一步表明雄激素可能通過PI3K/Akt通路減輕心肌細胞凋亡從而改善心功能。

圖3 免疫組化檢測心肌組織中p-Akt、p-PI3K、Caspase-3蛋白表達(×200)

3 討 論

正常情況下T是維持生命體各臟器功能及結構的重要內分泌激素，T對維持心臟功能及結構也起到一定作用。近年來研究發現心血管系統對雄激素特別敏感，雄激素直接影響心血管系統的血管和心臟，血清T濃度會隨著年齡的增長而降低，T水平的降低與過早的冠狀動脈疾病、對動脈粥樣硬化性心血管疾病危險因素的不利影響及與年齡無關的心血管死亡風險的增加有關〔1〕。越來越多的證據表明激素缺乏在CHF中起著重要作用〔2～6〕。特別是雄激素缺乏在CHF患者中很常見，并且與發病率和死亡率的增加有關〔7,8〕。

Jankowska等〔9〕對208例CHF患者和366名健康男性進行對照研究，所有紐約心臟協會(NYHA)心功能分級的HF中都發現了較低的T水平。研究表明〔10〕，男性CHF患者T水平降低預示預后不良，并與死亡率增加有關。有研究也證實在CHF患者及大鼠外周循環中雄激素較正常對照組是降低的〔11,12〕。因此雄激素在HF患者中被證實是普遍減少的，但補充雄激素對改善心功能的是有分歧的。一項前瞻性、隨機、雙盲、安慰劑對照試驗〔13〕比較CHF合并射血分數降低(HFrEF)的T缺乏男性患者用T替代與安慰劑的療效，每3個月肌肉注射長效十一酸T固定劑量為1 000 mg。安慰劑組接受等滲鹽水血清，患者在接受最佳藥物治療的同時，隨機分為T或安慰劑組，研究進行了12個月，最終樣本包括29例患者，安慰劑組15例，T組14例〔年齡(65±8)歲，62%有缺血的病因，左室射血分數(LVEF)為(30±6)%，NYHA心功能分級Ⅱ占 69%〕。12個月后，T替代組T水平明顯增加(P=0.002)，但在臨床癥狀和功能方面〔包括NYHA分級、弗雷明漢評分、明尼蘇達生活性CHF問卷、6 min步行距離(6MWD)、LVEF及距離N末端前腦鈉肽(NT-proBNP)〕未見獲益。未觀察到T治療相關的明顯不良反應。在其他激素、代謝和骨代謝生物標志物中沒有發現影響。在HFrEF和T缺乏癥患者中，替代治療無顯著成效。而另一項研究〔14〕選取50歲男性患有充血性HF的患者,安慰劑對照試驗和試驗組，試驗組肌肉(臀部)長效注射雄激素T(庚酸T 250 mg/ml)；對照組接受肌內注射生理鹽水(1 ml)。兩組患者體重、血流動力學參數及左室容積超聲心動圖指標均具有可比性。對于舒張功能狀態的改變，使用心肌做功指數，使用睪酮后該參數得到明顯改善。與接受安慰劑的組不同，接受T組在研究期間的6MWD參數有顯著增加的趨勢(P=0.019)。在調整基線變量后，各研究組之間的6MWD變化趨勢差異仍然顯著(F=4.402,P=0.045)。本研究加強了對T在改善CHF患者功能能力和生活質量中的有益作用。證實了適量補充雄激素可能有助于改善心功能。

目前有關雄激素在HF中的機制研究較少且不明確，有研究〔15〕認為核因子(NF)-κB信號可能是T治療心肌益處的重要分子基礎。T有廣譜的免疫調節作用，可抑制巨噬細胞的活性，降低血漿腫瘤壞死因子(TNF)-α，研究發現T可抑制NF-κB的激活，上調NF-κB抑制物(Iκ-B)的表達，間接抑制中性粒細胞CD11/CD18的表達，從而抑制炎癥因子分泌。低T水平被發現與增加代謝風險和系統炎癥有關。由于脂肪組織是炎性細胞因子的來源，T可能通過作用于脂肪組織來調節炎癥。在冠狀動脈疾病、前列腺癌和糖尿病患者中觀察到T可能抑制炎癥反應，通過抗炎細胞因子白細胞介素(IL)-10的增加和減少促炎細胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)來達到〔16〕。T缺乏與促炎細胞因子增加有關，T替代降低促炎細胞因子。也有動物實驗〔17〕證實T替代治療能減輕衰老大鼠心肌纖維化和凋亡，并認為至少部分通過提高生長停滯特異性蛋白(Gas)6的表達而減輕心肌纖維化和心肌細胞凋亡。

PI3K-Akt通路是心肌細胞凋亡的重要通路，PIP3可以與下游的信號分子3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(PDK)及Akt結合轉導信號。Akt(PKB)可被PDK1和PDK2磷酸化而激活，產生多種生物學效應，如促進葡萄糖轉運體(GluT)1和4轉位到細胞膜上，攝取葡萄糖，蛋白質合成，抑制細胞凋亡等。本研究說明雄激素可能有激活PI3K/Akt通路的作用。另外Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶。Caspase-3最主要的底物與DNA修復、基因完整性監護有關，Caspase-3對于細胞的凋亡具有明顯的促進作用〔18，19〕。本研究結果表明雄激素通過激活PI3K/Akt通路緩解心肌細胞凋亡從而改善心功能。免疫組化結果進一步表明雄激素可通過PI3K/Akt通路減少心肌細胞凋亡從而改善心功能。

目前超生理劑量下，雄激素可能有毒性作用，有研究〔20〕顯示半胱氨酸T和司他諾佐洛爾可合成代謝型雄激素(AAS)，是一種具有類似T功能的合成物質。實驗中使用了30只雌性瑞士老鼠。動物接受超生理劑量的AAS 30 d，兩種AAS均顯著改變心臟形態:丙酸T導致心室腔增大，司他諾佐洛爾增加左心室心肌厚度?？傊?，在超過生理劑量下使用AAS可改變心臟形態，可能嚴重影響健康。在生理水平上，T是安全的，并對心肌功能產生有益影響。多種激素和代謝紊亂與CHF的發展之間的聯系已成為研究熱點〔21〕，合成代謝力和分解代謝力的失衡可能是CHF發生的原因。激素替代治療的有益影響有助于改善CHF的進程，雄激素可能在其中發揮重要作用。