尪痹舒通過調控Th17/Tregs平衡緩解類風濕關節炎進展

萬彬彬 楊惠琴 (武漢市第一醫院風濕免疫科，湖北 武漢 430022)

類風濕關節炎(RA)臨床特征主要為關節結構腫脹與炎癥、慢性進行性病程，可導致關節功能喪失，是一種頑固的慢性全身性自身免疫疾病〔1〕。其主要的病理改變為關節骨質與軟骨的破壞及滑膜慢性炎癥，目前RA的發病機制尚不明確，但較多的研究提到Tregs與Th17細胞對其具有重要的影響〔2〕。RA發病可能是一種受抗原驅動的“激發-連鎖反應”過程，其發病與病情遷延的中心環節為感染與自身免疫反應，而環境、遺傳與內分泌因素等增加了RA的易感性〔3〕。多數西藥對RA也僅能在一定程度控制炎癥與疼痛，目前尚無特效藥，并不能有效地治療RA〔4,5〕。中醫學認為，RA屬“痹癥”范疇，深入了解RA療效機制，對提高患者生活質量意義重大，尪痹舒具有活血通絡、祛風止痛、滋補肝腎、益氣補血等功效〔6〕。本文探討尪痹舒通過調控Th17/Tregs平衡緩解RA進展的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 選取40只清潔級、SD大鼠，6～8周齡，平均(6.9±0.6)周齡，體重200～230 g，平均(215.4±20.6)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供〔動物批準文號：SCXK(滬)2013-0018〕，大鼠實驗前均適應性飼養在中科院動物飼養中心，且經中科院倫理委員會批準。主要試劑及儀器：甲氨蝶呤(通化茂祥制藥有限公司，批號：國藥準字H22022674，規格2.5 mg×100片)；完全弗氏佐劑(上海尚寶生物科技有限公司生產，型號：F5881-10)；顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；一抗、二抗(北京中杉金橋生物技術公司)；CO2培養箱(美國Thermo-fisher公司)。

1.2RA模型建立 模型組、甲氨蝶呤組及尪痹舒組大鼠腹腔麻醉使用5%水合氯醛0.8 ml/100 g，常規皮膚消毒在右后足跖底部取3個點，皮內注射0.1 ml完全弗氏佐劑。正常組處理方法與其他組相同，完全弗氏佐劑使用生理鹽水代替。

1.3用藥及分組 建模成功，正常組大鼠10只，將其他大鼠隨機分為模型組、甲氨蝶呤組及尪痹舒組各10只，正常組、模型組給予等量的生理鹽水；甲氨蝶呤組給予甲氨蝶呤10 mg，1次/w；尪痹舒組給予尪痹舒，藥物組成：馬錢子0.3 g、白芥子5 g、赤芍10 g、香附5 g、黃柏3 g、蒼術6 g、僵蠶3 g組成，煎服300 ml，1劑/d，分3次用藥，連續干預4 w。

1.4觀察指標 關節腫脹數使用游標卡尺測量4組大鼠雙后肢足墊厚度，兩個分值相加為每只大鼠關節評分；關節疼痛指數、關節壓痛指數采用慢性關節測定評分方法測定，大鼠安靜時檢測，固定10 min后，每隔5 s進行1次，大鼠踝關節做被動跖屈運動，共5次，取平均值，根據大鼠嘶叫與縮腿反應。

1.5病理學觀察 干預后，取后踝關節部分分離關節滑膜組織，10%甲醛固定24 h，經脫鈣、脫水、透明及包埋等處理制成石蠟塊，保存待用。將組織進行切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察病理學變化。

1.6類風濕因子(RF)、C反應蛋白(CRP)及紅細胞沉降率(ESR)水平檢測 干預后，抽取大鼠下腔靜脈血3 ml，以1 000 r/min低溫離心15 min，取血清。采用免疫比濁法檢測RF水平；采用ELISA檢測CRP水平；采用魏氏血沉法檢測ESR水平。

1.7轉化生長因子(TGF)-β1、白細胞介素(IL)-17及IL-10水平檢測 采用雙抗體夾心法檢測TGF-β1、IL-17及IL-10水平。

1.8Western印跡檢測核孤兒受體(ROR)-γt、叉頭翼狀螺旋轉錄因子(Fox)p3蛋白 將所采集到的所有標本，進行研磨，然后加入蛋白緩沖液，常規蛋白提取，二喹啉甲酸(BCA)法定量分析。50 μg蛋白樣品上樣后十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在TBST中將5%的脫脂奶粉避光封閉1 h，洗滌后加入一抗稀釋溶液(ROR-γt、Foxp3按照1∶1 000比例進行稀釋)，在4℃的環境中保存過夜，洗滌后加入二抗稀釋溶液(ROR-γt、Foxp3按照1∶5 000比例進行稀釋)，在溫床中孵育1 h后再次洗滌，加入電化學發光(ECL)液，使軟件分析蛋白條帶灰度值，內參蛋白是GAPDH。

1.9統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行方差分析、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.14組關節腫脹數、關節疼痛指數與關節壓痛指數比較 與正常組比較，其余3組關節腫脹數、關節疼痛指數與關節壓痛指數明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，甲氨蝶呤組、尪痹舒組關節腫脹數、關節疼痛指數與關節壓痛指數明顯降低(P<0.05)；與甲氨蝶呤組比較，尪痹舒組關節腫脹數、關節疼痛指數與關節壓痛指數明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 4組關節腫脹數、關節疼痛指數與 關節壓痛指數比較分，n=10)

2.24組關節組織病理學觀察 正常組膝關節滑膜無充血及水腫，細胞排列整齊，關節軟骨完整，無炎性細胞浸潤，無剝離及壞死，組織完整；模型組關節軟骨面糜爛，滑膜內血管增生，肉芽組織形成，細胞顯著增生；甲氨蝶呤組滑膜血管水腫、充血，見炎性細胞浸潤，表層細胞增，呈“柵欄”狀排列；尪痹舒組未見明顯炎細胞浸潤及血管增生，間質多為脂肪組織，纖維化不明顯，充血程度、滑膜腫脹及滑膜細胞增生減輕。見圖1。

圖1 4組關節組織病理學觀察(HE染色，×200)

2.34組RF、CRP及ESR水平比較 與正常組比較，其余3組RF、CRP及ESR水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，甲氨蝶呤組、尪痹舒組RF、CRP及ESR水平明顯降低(P<0.05)；與甲氨蝶呤組比較，尪痹舒組RF、CRP及ESR水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

2.44組TGF-β1、IL-17及IL-10水平比較 與正常組比較，其余3組IL-17水平明顯升高，TGF-β1、IL-10水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，甲氨蝶呤組及尪痹舒組IL-17水平明顯降低，TGF-β1、IL-10水平明顯升高(P<0.05)；與甲氨蝶呤組比較，尪痹舒組IL-17水平明顯降低，TGF-β1、IL-10水平明顯升高(P<0.05)。見表2。

2.54組ROR-γt、Foxp3蛋白表達比較 與正常組比較，其余3組ROR-γt蛋白表達明顯升高，Foxp3蛋白表達明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，甲氨蝶呤組、尪痹舒組ROR-γt蛋白表達明顯降低，Foxp3蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與甲氨蝶呤組比較，尪痹舒組ROR-γt蛋白表達明顯降低，Foxp3蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見表3、圖2。

表2 4組RF、CRP、ESR、TGF-β1、IL-17及IL-10水平比較

表3 4組ROR-γt、Foxp3蛋白表達比較

圖2 4組ROR-γt、Foxp3蛋白表達

3 討 論

RA經常伴有關節外器官受累，致殘與致畸率較高，其病程長，是臨床上常見的高致殘性風濕免疫病，是一種進行性、慢性的累及關節的自身免疫性疾病〔7〕。RA患病率在我國較高，很多患者沒有接受規范治療，患病人群構成復雜，嚴重影響患者預后。RA中醫學上屬痹癥，痹，即痹阻不通，《臨證指南醫案》〔8〕中指出痹者，臟腑經絡不能暢達，正氣為邪所阻，閉而不通之謂，濕、寒、風三氣得以乘虛外襲，體內留置，導致濕痰濁血留注凝澀而德之〔9〕。相關研究表明，痰瘀是本病中晚期發病的重要病理因素，正氣虧虛為本，多以濕熱偏盛為主，病情遷延郁久化熱，從陽化熱，復感外邪〔10〕。

尪痹舒中黃柏、蒼術、僵蠶組成,黃柏、蒼術即二妙散具清熱燥濕功效，為濕熱痹痛常用藥。白芥子具有豁痰利氣，散結通絡止痛，僵蠶具有化痰散結、祛風止痛解痙的功效，兩者聯合用于治療痰濕流注，關節腫脹麻木、疼痛諸癥。馬錢子，通絡止痛，散結消腫。赤芍具有清熱涼血、散瘀止痛的功能。香附為佐藥具有利三焦、解六郁的功用，有和胃理氣止痛作用，為氣病之總司但對痰、瘀、食、濕等諸郁均有效，對于以上諸藥對胃的刺激有一定的緩解作用。諸藥和用共奏清熱除濕、祛痰活血、通痹消腫的功效。本研究說明尪痹舒顯著改善關節腫脹數、關節疼痛指數與關節壓痛指數。赤芍涼血活血、清熱，對細菌有明顯的抑制作用〔11〕。本研究說明尪痹舒顯著降低RF、CRP及ESR水平。Tregs細胞通過釋放細胞因子IL-10等降低炎癥因子產生與抗體分泌，是T細胞亞群中具有免疫抑制活性的一類，發揮免疫效應〔12〕。IL-17在RA早期炎癥反應中起重要作用，誘導炎性細胞釋放促炎因子，上調免疫應答，促進滑膜成纖維細胞、內皮細胞釋放IL-8、IL-6，導致滑膜異常增生〔13〕。TGF-β1與關節炎的病理改變有關，可顯著抑制機體的炎癥反應與免疫反應〔14〕。機體Th17/調節性T細胞的失衡與相關細胞因子的異常在RA的發病中發揮重要的作用，是與免疫細胞比例異常的重要原因〔15〕。Th17細胞/調節性T細胞亞群失衡可導致RA骨質破壞。Th17細胞可分泌IL-17，IL-17能夠對細胞外基質損傷起到促進愈合作用，也可對組織炎癥具有明顯的促進作用〔16〕。Tregs細胞可通過產生的細胞因子包括TGF-β1與IL-10等在RA中起免疫抑制作用，也可直接發揮免疫抑制作用〔17,18〕。本研究結果說明尪痹舒顯著改善炎癥反應。此外，尪痹舒明顯降低ROR-γt蛋白表達，升高Foxp3蛋白表達。Foxp3蛋白是Tregs的特異性標志物，維持Tregs活性的關鍵因素為Foxp3持續表達〔19〕。ROR-γt是Th17細胞特異性的轉錄調控因子，作為促進細胞分化的關鍵轉錄調節因子參與了體內Th17細胞介導的炎癥反應及體外細胞因子誘導Th17細胞的分化〔20〕。

綜上，尪痹舒可通過誘導Tregs細胞生成同時抑制Th17細胞分化，是病變部位Th17/Tregs恢復平衡，可調控Th17/Tregs改善炎癥反應與ROR-γt、Foxp3蛋白表達。