miR-216a-5p靶向RAB1A基因調(diào)控食管癌細胞增殖、遷移及侵襲的分子機制

杜容宇 靳永欣 馬銀龍 常浩 趙一帆

(河南科技大學(xué)附屬許昌市中心醫(yī)院胸心外科，河南 許昌 461000)

食管癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤，早期多無癥狀，患者確診時多為中晚期，因此化療、放療和靶向治療是其主要治療方法，其侵襲性導(dǎo)致患者預(yù)后較差，生存率低〔1,2〕。miR-216a-5p在肺癌組織及細胞系中表達明顯降低，上調(diào)miR-216a-5p可抑制肺癌細胞侵襲〔3〕及惡性進展〔4〕。miR-216a-5p還可通過靶向調(diào)控己糖激酶(HK)2表達抑制葡萄膜黑色素瘤的生長〔5〕，在前列腺癌中l(wèi)ncRNA HOTTIP靶向抑制miR-216a-5p促進癌細胞增殖和遷移〔6〕。Ras相關(guān)蛋白Rab-1A(RAB1A)基因在舌癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌及子宮頸癌等多種惡性腫瘤中均出現(xiàn)高表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)〔7〕。本研究探討miR-216a-5p對食管癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響及分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 美國ATCC公司提供人食管癌細胞株Eca109、EC9706和KYSE450及正常食管上皮細胞Het-1A；美國Gibco公司提供DMEM高糖培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基；美國Sigma-Aldrich公司提供牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶；日本同仁化工提供CCK8試劑盒；美國Corning公司提供Transwell板；英國Abcam公司提供RAB1A抗體、細胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體、p21抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2抗體、MMP-9抗體、人表皮生長因子受體(EGFR)抗體、蛋白激酶B(AKT)抗體、mTOR抗體、p-EGFR抗體、p-AKT抗體、p-mTOR抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體；上海吉瑪制藥有限公司提供引物、miR-216a-5p模擬物(miR-216a-5p)、抑制劑(anti-miR-216a-5p)、RAB1A的過表達載體(pcDNA-RAB1A)、空載體和陰性對照(miR-NC和anti-miR-NC)及雙熒光載體的構(gòu)建；美國Promega公司提供雙熒光素酶報告系統(tǒng)；美國Invitrogen公司提供Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、總RNA提取試劑盒、 實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒；美國Abcam公司提供抗RAB1A抗體和GAPDH抗體；美國Bio-Rad公司提供顯微鏡、發(fā)光儀、酶標儀及實時熒光定量PCR儀；上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將食管癌細胞Eca109和KYSE450培養(yǎng)于含10 %胎牛血清(FBS)、1%青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，食管癌細胞EC9706和人正常食管上皮細胞Het-1A培養(yǎng)于含10%FBS、1%青-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的Eca109細胞稀釋為1×106個細胞/ml，接種于6孔板中，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染，miR-216a-5p過表達組：miR-NC組和miR-216a-5p組；miR-216a-5p抑制劑組：anti-miR-NC組和anti-miR-216a-5p組；miR-216a-5p和RAB1A雙過表達組：miR-216a-5p+pcDNA組和miR-216a-5p+pcDNA-RAB1A組；RAB1A野生型(WT-RAB1A)和突變型(MUT-RAB1A)雙熒光載體，將等體積脂質(zhì)體和各組載體片段輕柔混勻，室溫孵育20 min，然后轉(zhuǎn)染Eca109細胞中，設(shè)置不轉(zhuǎn)染的空白對照，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，換成RPMI1640完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h，收集細胞，進行后續(xù)實驗。

1.2.3實時熒光定量-PCR檢測RNA的表達 按照總RNA提取試劑盒說明書提取正常食管上皮細胞和各組食管癌細胞總RNA，以RNA為模板按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板按照實時熒光定量PCR的說明書進行反應(yīng)合成miR-216a-5p和RAB1A mRNA，運用2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4CCK-8法檢測細胞增殖 Eca109細胞轉(zhuǎn)染48 h后以4×103個/孔接種于96微孔板中，分別在培養(yǎng)至24、48和72 h，棄上清后每孔避光加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，酶標儀測定OD450 nm吸光度(A)值。

1.2.5Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲 遷移實驗：上室中接種各組Eca109細胞后將500 μl含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基加入下室，甲醛固定遷移的細胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察計數(shù)，隨機選取視野5個，取均值。侵襲實驗：基質(zhì)膠稀釋后加入上室后接種各組Eca109細胞，后續(xù)實驗步驟同遷移實驗。

1.2.6雙熒光素酶報告實驗 WT-RAB1A和MUT-RAB1A載體分別與miR-NC或miR-216a-5p共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)好的Eca109細胞，轉(zhuǎn)染48 h，收集細胞后檢測熒光素酶活性。

1.2.7Western印跡 提取Het-1A細胞和各組食管癌細胞蛋白并檢測濃度。將蛋白樣本進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗，RAB1A抗體(1∶1 000)、CyclinD1抗體(1∶2 500)、p21抗體(1∶2 000)、MMP-2抗體(1∶200)、MMP-9抗體(1∶3 000)、EGFR抗體(1∶2 000)、AKT抗體(1∶1 500)、mTOR抗體(1∶1 000)、p-EGFR抗體(1∶2 000)、p-AKT抗體(1∶2 000)、p-mTOR抗體(1∶1 500)和抗GAPDH抗體(1∶2 000)，4℃孵育過夜。洗膜3次，然后加入稀釋的酶標二抗，室溫孵育1 h。以GAPDH為內(nèi)參，分析蛋白水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1食管癌細胞系中miR-216a-5p與RAB1A的表達量 與正常食管上皮細胞Het-1A相比，在食管癌細胞Eca109、EC9706和KYSE450組中RAB1A 的mRNA和蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，miR-216a-5p表達量顯著降低(P<0.05)，見表1和圖1。

2.2miR-216a-5p過表達可抑制食管癌Eca109細胞增殖、遷移和侵襲 與miR-NC組相比，miR-216a-5p組Eca109細胞中p21表達水平顯著升高(P<0.05)，細胞活力和CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，遷移和侵襲細胞數(shù)顯著減少(P<0.05)。見圖2，表2。

表1 miR-216a-5p和RAB1A在食管癌細胞和 正常食管上皮細胞中的表達

1～4：Het-1A組,Eca109組,EC9706組,KYSE450組圖1 RAB1A在食管癌細胞和正常肝細胞中的表達

1～3：空白對照組，miR-NC組，miR-216a-5p組圖2 Western印跡檢測細胞增殖、 遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達

表2 miR-216a-5p過表達對食管鱗癌Eca109細胞增殖、遷移及侵襲的影響

2.3miR-216a-5p靶向調(diào)控RAB1A的表達 Targetscan預(yù)測結(jié)果顯示，RAB1A的3′UTR序列中含有與miR-216a-5p互補的核苷酸序列，見圖3。與miR-NC組相比，過表達miR-216a-5p可使WT-RAB1A的熒光素酶相對活性顯著降低(P<0.05)，見表3。anti-miR-216a-5p組RAB1A蛋白水平(0.98±0.13)顯著高于anti-miR-NC組(0.63±0.11，P<0.05)；miR-216a-5p組RAB1A蛋白水平(0.30±0.05)顯著低于miR-NC組(0.60±0.10，P<0.05)。見圖4。

圖3 RAB1A的3′UTR中含有與 miR-216a-5p互補的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

1～4：anti-miR-NC組，anti-miR-216a-5p組，miR-NC組，miR-216a-5p組圖4 miR-216a-5p靶向調(diào)控RAB1A蛋白表達

2.4RAB1A過表達聯(lián)合miR-216a-5p過表達對細胞增殖、遷移及侵襲的影響 miR-216a-5p+pcDNA-RAB1A組細胞活性、遷移及侵襲細胞數(shù)、CyclinD1及MMP-9水平均顯著高于miR-216a-5p+pcDNA組(P<0.05)。見表4、圖5。

表4 RAB1A過表達逆轉(zhuǎn)miR-216a-5p過表達對食管鱗癌Eca109細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用

1,2:miR-216a-5p+pcDNA組，miR-216a-5p+pcDNA-RAB1A組圖5 Western印跡檢測各組細胞增殖、 遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達

2.5RAB1A過表達逆轉(zhuǎn)miR-216a-5p過表達對Eca109細胞EGFR/AKT/mTOR信號通路的抑制作用 與miR-NC組相比，miR-216a-5p組的EGFR、AKT和mTOR蛋白表達量無明顯變化(P>0.05)，p-EGFR、p-AKT和p-mTOR表達均顯著降低(均P<0.05)；與miR-216a-5p+pcDNA組相比，miR-216a-5p+pcDNA-RAB1A組EGFR、AKT和mTOR蛋白表達量無顯著變化(P>0.05)，p-EGFR、p-AKT和p-mTOR表達均顯著升高(均P<0.05)。見表5、圖6。提示過表達miR-216a-5p可抑制Eca109細胞EGFR/AKT/mTOR通路，過表達RAB1A逆轉(zhuǎn)了過表達miR-216a-5p對EGFR/AKT/mTOR通路的抑制作用。

表5 RAB1A過表達逆轉(zhuǎn)miR-216a-5p過表達對Eca109細胞EGFR/AKT/mTOR信號通路的抑制作用

1～4:miR-NC組，miR-216a-5p組，miR-216a-5p+pcDNA組，miR-216a-5p+pcDNA-RAB1A組圖6 Western印跡檢測Eca109細胞中 EGFR/AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達

3 討 論

中國太行山地區(qū)是食管癌的高發(fā)地區(qū)，接觸致癌物質(zhì)和營養(yǎng)缺乏可能是食道癌的主要危險因素〔8〕，雖然治療方法有極大改進和提高，但食管癌確診時多已發(fā)展至晚期，患者的治療效果很差。

研究表明，miRNA在食管癌中的異常表達可能影響癌細胞的凋亡、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物過程，并與食管癌的診斷、預(yù)后及多藥耐藥性有關(guān)〔9,10〕。研究表明，miR-216a-5p被認為是一種癌基因，與多種癌癥，如腎細胞癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、前列腺癌等進展和轉(zhuǎn)移有關(guān)〔11〕。miR-216a-5p在肝癌和乳腺癌中均是lncRNA DANCR的靶點，DANCR可靶向miR-216a-5p抑制癌細胞的增殖和侵襲〔12,13〕。 本研究結(jié)果說明miR-216a-5p在食管癌發(fā)展中具有重要作用。此外，本研究結(jié)果提示RAB1A可能是miR-216a-5p的靶基因。RAB1A是小GTPase的Rab家族成員，在調(diào)節(jié)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體和高爾基隔間內(nèi)的小泡運輸中有很好的功能，RAB1A通過特定的下游效應(yīng)器途徑控制整合素β1的循環(huán)和定位到脂質(zhì)筏，從而調(diào)節(jié)細胞遷移〔14〕。在卵巢癌中，RAB1A是miR-655-3p的靶基因，可抑制癌細胞的增殖和遷移〔15〕。RAB1A在胃癌和結(jié)直腸癌中均過表達，其高表達與腫瘤的浸潤和分期有關(guān)，且均與mTOR的靶向耐藥相關(guān)〔16,17〕。本研究結(jié)果證實了RAB1A在miR-216a-5p對食管癌的調(diào)控中發(fā)揮作用。有研究表明，RAB1A是mTOR的激活劑〔16,17〕，因此本研究假設(shè)miR-216a-5p靶向RAB1A通過EGFR/AKT/mTOR通路在食管癌中發(fā)揮抑癌作用，結(jié)果表明過表達miR-216a-5p可抑制Eca109細胞的EGFR/AKT/mTOR通路，過表達RAB1A逆轉(zhuǎn)了miR-216a-5p過表達對EGFR/AKT/mTOR通路的抑制作用，進一步驗證了miR-216a-5p與RAB1A的靶向調(diào)控關(guān)系。

綜上，在食管癌Eca109細胞中過表達miR-216a-5p可靶向抑制RAB1A的表達，可能通過抑制EGFR/AKT/mTOR通路進而抑制Eca109細胞增殖、遷移和侵襲。