歸脾丸對(duì)小鼠抑郁行為及單胺遞質(zhì)的影響*

韋宇婷，鐘 靜，鐘振國(guó)，梁明坤

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院

歸脾湯是治療心脾兩虛的經(jīng)典名方，出自宋代嚴(yán)用和《濟(jì)生方》，由黨參、白術(shù)、當(dāng)歸、茯苓、黃芪、遠(yuǎn)志、龍眼肉、酸棗仁、木香、炙甘草、生姜、大棗等12 味中藥組成，具有益氣補(bǔ)血，健脾安神功效，可用于神經(jīng)衰弱、失眠、頭暈等癥，對(duì)抑郁癥社會(huì)認(rèn)知、社會(huì)交往、抑郁焦慮及失眠等有改善作用［1-2］。歸脾丸（濃縮丸）是歸脾湯的成方劑型之一，其具體抗抑郁作用和機(jī)制尚不明確。本研究旨在觀察歸脾丸對(duì)抑郁模型小鼠血漿5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、去 甲 腎 上 腺 素(norepinephrine，NE)、多巴胺（dopamine,DA)含量及行為學(xué)、體溫、眼瞼下垂的影響，探討歸脾丸的抗抑郁作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物雄性SPF 級(jí)ICR 小鼠，7～8周齡，體質(zhì)量20～22g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)溫度（24±1）℃，12 h 人工循環(huán)光照（光照期8∶00～20∶00），自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。每只動(dòng)物僅用于一個(gè)單一的實(shí)驗(yàn)并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 儀器ANY-maze型動(dòng)物行為分析系統(tǒng)（美國(guó)Stoelting 公司）；M200PRO 型連續(xù)波長(zhǎng)檢測(cè)儀（INFINITE）；KD3311型醫(yī)用電子體溫計(jì)（北京康祝醫(yī)療器械有限公司）；自制全透明強(qiáng)迫游泳圓筒及懸尾實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)箱。

1.3 藥品與試劑歸脾丸（仲景宛西制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z41021897）；鹽酸氯米帕明（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H32022974）；利血平注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020905）；小鼠5-HT 酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司，貨號(hào)：JL12087）；小鼠NE 酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：C0129030154）；小鼠DA 酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：C0129050156）。

1.4 方法

1.4.1 利血平拮抗實(shí)驗(yàn)［3］將小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性藥組（鹽酸氯米帕明40 mg/kg）及 歸 脾 丸 高（2.73g/kg）、中（1.65g/kg）、低（0.6825 g/kg）劑量組，每組10 只，均按20 mL/kg灌胃給藥。每日1次，連續(xù)給藥7天，空白組、模型組給予等量0.9%NaCl 溶液。末次給藥前測(cè)小鼠基礎(chǔ)肛溫，將電子體溫計(jì)探頭經(jīng)甘油潤(rùn)滑后插入小鼠肛內(nèi)約1.5 cm處測(cè)量，除空白組外，其余各組按2 mg/kg腹腔注射利血平，同時(shí)灌胃藥物或生理鹽水，空白組腹腔注射等量0.9%NaCl 溶液［4］。注射利血平4 h 后，用溫度計(jì)測(cè)量小鼠肛溫；觀察各組小鼠眼瞼閉合狀況：完全開眼0 分，1/4 閉眼1分，1/2閉眼2分，3/4閉眼3分，完全閉眼4分。

1.4.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（forced swimming test，F(xiàn)ST）［5］小鼠具體分組及給藥方式、劑量、時(shí)間同“1.4.1”項(xiàng)，于末次給藥1 h 后，將小鼠放于直徑25 cm，高40 cm 的透明圓柱形玻璃缸中，缸內(nèi)水深15 cm，水溫（24±1）℃。小鼠在水中停止掙扎，僅有微小肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部浮在水面，即表現(xiàn)出絕望狀態(tài)，則視為小鼠FST 不動(dòng)時(shí)間。從小鼠入水后共計(jì)時(shí)6 min，其中適應(yīng)2 min，記錄后4 min內(nèi)累計(jì)不動(dòng)時(shí)間（s）。

1.4.3 懸 尾 實(shí) 驗(yàn)（tail suspension test，TST）［6］小鼠具體分組及給藥方式、劑量、時(shí)間同“1.4.1”項(xiàng)，于末次給藥1 h后，用膠布將小鼠尾部1 cm處粘掛于懸尾箱內(nèi)，使其呈倒懸狀態(tài)，小鼠頭部距離地面30 cm，小鼠為了克服倒懸異常體位而掙扎，但掙扎一段時(shí)間后出現(xiàn)間斷性不動(dòng)，即表現(xiàn)出失望狀態(tài)，小鼠停止掙扎或無任何活動(dòng)的時(shí)間視為小鼠TST不動(dòng)時(shí)間。用攝像設(shè)備記錄，小鼠放入懸尾箱內(nèi)共6 min，其中適應(yīng)2 min，記錄后4 min累計(jì)不動(dòng)時(shí)間（s）。

1.4.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open field test，OFT）［7］小鼠具體分組及給藥方式、劑量、時(shí)間同“1.4.1”項(xiàng)，于末次給藥1 h 后，將小鼠放入敞箱，敞箱裝置為長(zhǎng)寬各60 cm，高25 cm，底面劃一個(gè)30 cm×30 cm 等邊方格木箱，使其與外框組成“回”字形方格，內(nèi)面用黑漆涂滿。將小鼠從邊緣放入裝置內(nèi)，用攝像設(shè)備觀察小鼠共7 min，其中適應(yīng)2 min，記錄后5 min內(nèi)總運(yùn)動(dòng)距離及穿越至中心方格次數(shù)（四爪均進(jìn)入方格方可計(jì)數(shù)），用75%酒精、1%次氯酸鈉徹底清潔敞箱后再觀察下一只小鼠。

1.4.5 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量測(cè)定最末次行為實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即麻醉，心臟采血0.5～1.0 mL，放入有EDTA抗凝劑的離心管內(nèi)，室溫下靜置30 min，4℃離心半徑10 cm，3000 r/min 離心15 min 后，取上清液，-80℃保存待測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠血漿單胺遞質(zhì)含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體溫和眼瞼下垂情況與空白組比較，模型組小鼠體溫急劇下降，小鼠完全閉眼，提示利血平誘發(fā)小鼠體溫下降及眼瞼下垂成功。與模型組比較，歸脾丸高、中、低劑量組可對(duì)抗小鼠腹腔注射利血平所引起的體溫下降（P＜0.001）及眼瞼下垂（P＜0.05，P＜0.01），說明歸脾丸具有抗利血平作用。見表1。

表1 各組小鼠體溫及眼瞼下垂情況比較（±s）

表1 各組小鼠體溫及眼瞼下垂情況比較（±s）

注：與空白組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01，###表示P＜0.001；與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001（下同）

組別空白組模型組陽(yáng)性藥組歸脾丸高劑量組歸脾丸中劑量組歸脾丸低劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825體溫（℃）37.8±0.6 32.1±0.6###35.5±0.6***36.8±0.5***36.1±0.8***35.6±0.7***眼瞼下垂評(píng)分（分）0 3.5±0.8###1.7±1.0**2.0±0.6**2.2±0.4*2.3±0.5*

2.2 小鼠FST 情況與空白組比較，模型組強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示抑郁造模成功。與模型組比較，陽(yáng)性藥組和歸脾丸高劑量組均可縮短小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。提示歸脾丸高劑量具有拮抗小鼠獲得性絕望行為的作用。見表2。

表2 各組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較（±s）

表2 各組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較（±s）

組別空白組模型組陽(yáng)性藥組歸脾丸高劑量組歸脾丸中劑量組歸脾丸低劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825不動(dòng)時(shí)間（s）14.9±11.0 107.9±41.6##50.5±38.4*33.0±5.9**81.5±36.0 79.3±64.9

2.3 小鼠TST 情況與空白組比較，模型組懸尾不動(dòng)時(shí)間增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示抑郁造模成功。與模型組比較，陽(yáng)性藥鹽酸氯米帕明可縮短小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。歸脾丸各劑量組與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 各組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間比較（±s）

表3 各組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間比較（±s）

組別空白組模型組陽(yáng)性藥組歸脾丸高劑量組歸脾丸中劑量組歸脾丸低劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825不動(dòng)時(shí)間（s）59.3±10.0 139.5±49.6##52.7±36.7**114.9±27.9 98.8±44.1 110.3±35.6

2.4 小鼠OFT 情況與模型組比較，陽(yáng)性藥鹽酸氯米帕明組5 min內(nèi)總運(yùn)動(dòng)距離增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。歸脾丸高劑量組5 min 內(nèi)總運(yùn)動(dòng)距離增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組小鼠5 min 內(nèi)進(jìn)入中心方格次數(shù)為（1.5±2.3）次，與各給藥組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 各組小鼠總運(yùn)動(dòng)距離及進(jìn)入中心方格次數(shù)比較（±s）

表4 各組小鼠總運(yùn)動(dòng)距離及進(jìn)入中心方格次數(shù)比較（±s）

組別空白組模型組陽(yáng)性藥組歸脾丸高劑量組歸脾丸中劑量組歸脾丸低劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825總運(yùn)動(dòng)距離（m）19.2±5.3 2.8±3.3###19.5±6.9***25.8±20.9*19.3±24.0 13.0±14.3進(jìn)入中心方格次數(shù)（次）15.3±5.8 1.5±2.3###2.8±2.9 4.2±3.0 2.6±3.7 2.3±2.7

2.5 小鼠血漿單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量與空白組比較，模型組小鼠血漿5-HT、NE、DA 含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），造模成功。與模型組比較，陽(yáng)性藥鹽酸氯米帕明和歸脾丸高、中、低劑量均能提高小鼠血漿NE、DA 含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量組能提高5-HT 含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表5。

表5 各組小鼠血漿單胺遞質(zhì)含量比較（±s）

表5 各組小鼠血漿單胺遞質(zhì)含量比較（±s）

組別空白組模型組陽(yáng)性藥組歸脾丸高劑量組歸脾丸中劑量組歸脾丸低劑量組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10劑量（g/kg）- -40 2.73 1.65 0.6825 5-HT（ng/mL）549.3±67.4 227.9±41.6##401.5±59.7**438.1±64.9**288.6±90.0 246.4±58.8 NE（pg/mL）30.67±6.1 12.67±5.5#39.26±7.1***38.87±8.1***20.88±19.8*29.28±15.8**DA（pg/mL）94.97±63.2 31.51±13.4#51.41±24.9*87.61±38.2***62.36±28.1*44.66±13.1*

3 討論

抑郁癥是多方因素綜合引發(fā)的情感性病癥，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。通過破壞機(jī)體與情緒有關(guān)的神經(jīng)環(huán)路影響5-HT、NE 和DA 神經(jīng)元及其通路，導(dǎo)致單胺遞質(zhì)水平降低，可使機(jī)體功能紊亂而引起抑郁［8］。中醫(yī)學(xué)對(duì)抑郁癥的認(rèn)識(shí)較早，對(duì)本病的描述內(nèi)容散見于郁證、百合病等疾病中。中醫(yī)認(rèn)為引發(fā)抑郁癥的原因主要是肝氣郁結(jié)、心脾兩虛、氣血肝腎不足等。中醫(yī)“郁證”以心情抑郁，痛無定處，納呆少寐，或急躁易怒，或多疑易驚為主要臨床表現(xiàn)［9］。齊元玲等［10］對(duì)抑郁癥中醫(yī)證候?qū)W臨床流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)心脾兩虛證在6 種常見中醫(yī)證候中排第二位，占15.0%。徐春燕等［11］研究發(fā)現(xiàn)心脾兩虛是抑郁癥常見中醫(yī)證候之一，占10.7%。孫志高等［12］調(diào)查了906 例抑郁癥患者，發(fā)現(xiàn)心脾兩虛占14.2%。歸脾湯具有益氣補(bǔ)血、健脾養(yǎng)心功效，主治心脾兩虛證，被廣泛應(yīng)用于健忘失眠、體倦食少、盜汗、便血等疾病。以往研究證明，歸脾湯具有改善模型動(dòng)物認(rèn)知、記憶力及增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞增殖的作用［13］，同時(shí)，歸脾湯的安全性已經(jīng)過臨床實(shí)踐驗(yàn)證，大、小鼠體內(nèi)的急性毒性和遺傳毒性實(shí)驗(yàn)研究也證明歸脾湯的安全性，無遺傳毒性影響［14］。目前，臨床尚未研制出一種治療抑郁癥的理想藥物。歸脾湯等傳統(tǒng)復(fù)方中藥用于治療本病療效較好［15］。研究表明，歸脾湯能提高抑郁模型動(dòng)物腦內(nèi)BDNF、5-HT、NE、DA 等神經(jīng)遞質(zhì)水平［9，13］，但歸脾丸抗抑郁機(jī)制是否與歸脾湯一致未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。單胺遞質(zhì)不足是抑郁癥發(fā)病的重要因素之一。單胺遞質(zhì)不足易引發(fā)腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞病變，破壞腦內(nèi)神經(jīng)元及其傳導(dǎo)通路，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)情感活動(dòng)有調(diào)控作用的遞質(zhì)降低［16］。本研究結(jié)果顯示：抑郁小鼠血漿中5-HT、NE、DA 水平較空白組降低，提示抑郁癥的發(fā)病機(jī)制可能與單胺遞質(zhì)神經(jīng)元及其通路被破壞有關(guān)。歸脾丸干預(yù)后抑郁小鼠血漿5-HT、NE、DA 水平較模型組升高，提示血漿中5-HT、NE、DA 的改變可能參與了抑郁行為的改善，推測(cè)歸脾丸可能促進(jìn)了單胺遞質(zhì)合成，從而發(fā)揮抗抑郁作用。

利血平誘發(fā)的抑郁癥動(dòng)物模型被廣泛應(yīng)用于抗抑郁藥物的篩選和評(píng)價(jià)［17］。利血平是一種囊泡再攝取抑制劑，易被單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）降解，使單胺遞質(zhì)（5-HT、NE、DA）耗竭，妨礙交感神經(jīng)沖動(dòng)傳遞，從而引起行為和生理的變化。給予利血平后小鼠即出現(xiàn)體溫下降、眼瞼下垂等癥狀［18］。本實(shí)驗(yàn)以體溫下降和眼瞼下垂為考察指標(biāo)，結(jié)果顯示歸脾丸高、中、低劑量均具有改善抑郁小鼠體溫下降的作用，同時(shí)對(duì)利血平引起的眼瞼下垂有一定改善作用。

小鼠FST、TST和OFT均為行為絕望實(shí)驗(yàn)，該狀態(tài)與人類抑郁癥發(fā)病時(shí)的生理病癥相似，故而此3 種模型可作為研究抑郁癥的主要模型［4］。歸脾丸具有改善利血平誘導(dǎo)的抑郁癥模型小鼠體溫下降和眼瞼下垂的作用，且能縮短小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，增加曠場(chǎng)總運(yùn)動(dòng)距離，提示歸脾丸具有較好的抗抑郁作用。歸脾丸中、低劑量對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間無影響，而高劑量組表現(xiàn)出明顯差異。提示歸脾丸抗抑郁作用存在量效關(guān)系，歸脾丸劑量越大，抗抑郁效果越好，但不同個(gè)體之間也存在差異。歸脾丸高、中、低劑量對(duì)小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間均無影響。歸脾丸高劑量組能增加小鼠OFT總運(yùn)動(dòng)距離，但對(duì)小鼠進(jìn)入中心方格次數(shù)無影響，可能由于利血平化較嚴(yán)重及中心方格距離太遠(yuǎn)。提示歸脾丸高劑量有良好的改善抑郁癥癥狀的效果。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明歸脾丸對(duì)抑郁癥有較好的改善作用，表現(xiàn)出與歸脾湯［12］相似的抗抑郁作用，其中高劑量抗抑郁效果較好，提示歸脾丸具有劑量方向性特點(diǎn)，但最佳劑量確定還需進(jìn)一步研究。其中，歸脾丸對(duì)利血平所致抑郁小鼠體溫下降及眼瞼下垂具有拮抗作用，能提高抑郁小鼠血漿5-HT、NE、DA 含量，表明其作用機(jī)制可能與增加血漿單胺遞質(zhì)含量有關(guān)。