乳疾清合劑的質量標準提高研究*

梁欣健，姜倩娥，王葉茗

1 廣州市中西醫結合醫院，廣東 廣州 510801；2 廣州市天河區中醫醫院

乳疾清合劑是廣州市中西醫結合醫院的醫療機構制劑，由延胡索、玄參、青皮、半夏、石菖蒲、雞內金、全蝎、薺苨等25 味中藥組成［1］，具有行氣活血、化痰散結的作用，臨床主要用于治療乳腺增生、乳腺腫瘤等乳腺囊性增生性疾病［2］。

乳疾清合劑已有近二十年的使用歷史，由治療乳腺增生疾病的民間經驗方“寶丹化積方”開發而成，但乳疾清合劑現行的質量標準缺乏有效的質量控制指標，為提高乳疾清合劑的質量控制要求，課題組開展了乳疾清合劑的質量標準提高研究工作，建立采用薄層色譜鑒定法研究乳疾清合劑的定性鑒別方法，參考《中華人民共和國藥典》2015 年版四部通則中的微生物限度檢查方法進行驗證性考察，并建立微生物限度檢查方法，現報道如下。

1 材料

1.1 儀器SW-CJ 型系列潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；RS-232 型精密電子天平［西特傳感技術（天津）有限公司］；HPX-9162 MBE 型數顯電熱培養箱（上海海迅實業有限公司醫療設備廠）；ZRH-150B 型生化培養箱（廣東省醫療器械廠）；LRH-150-M 型霉菌培養箱（廣東省醫療器械廠）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；PYX-DHS-35 型電熱恒溫水浴鍋（上海躍進醫療器械廠）；KQ-100DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-2000A 型旋轉蒸發儀（上海左樂儀器有限公司）。

1.2 試藥乳疾清合劑（廣州市中西醫結合醫院制劑室，批號：160501，160502，160503）；延胡索對照藥材（批號：120928-201208）、延胡索乙素對照品（批號：110726-201213）、玄參對照藥材（批號：121008-201308）、法半夏對照藥材（批號：121172-201103）及青皮對照藥材（批號：121155-200502）均購自中國食品藥品檢定研究院；金黃色葡萄球菌［批號：CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌［批號：CMCC（B）10104］、枯草芽孢桿菌［批號：CMCC（B）63501］、白色念珠菌［批號：CMCC（B）98001］、黑曲霉［批號：CMCC（B）98003］、大腸埃希菌［批號：CMCC（B）44102］、沙門菌［批號：CMCC（B）50094］均購自中國藥品食品檢定研究院。硅膠G 薄層層析板、硅膠GF254 薄層層析板購自青島海洋化工有限公司；胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號：20160621）、胰酪大豆胨液體培養基（批號：20160702）、麥康凱瓊脂培養基（批號：20160708）、麥康凱液體培養基（批號：20160624）、沙氏葡萄糖液體培養基（批號：20160711）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號：20160224）、RV 沙門菌增菌液體培養基（批號：20160405）、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基（批號：20160408）、無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：20160316）均購自青島海博生物技術有限公司；聚山梨酯-80（批號：20160503）購自湖南爾康制藥有限公司，濃氨水、乙醚、甲醇、甲苯、丙酮、正丁醇、三氯甲烷、香草醛、硫酸、乙酸乙酯、甲酸為分析純，購自廣州化學試劑廠，水為制劑生產用純化水。

2 方法和結果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 延胡索取乳疾清合劑60 mL，加濃氨水將其pH值調至11，加乙醚提取2次，每次30 mL，合并乙醚液，置水浴鍋蒸干，殘渣加甲醇2 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取延胡索對照藥材1 g，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL 使溶解，加濃氨水將其pH 值調至11，用乙醚振搖提取3 次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，制成延胡索對照藥材溶液。再取延胡索乙素對照品，加甲醇制成每毫升含0.5 mg 的溶液，作為對照品溶液。吸取上述3種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮（9∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中在與對照藥材及對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照樣品無干擾，見圖1。

圖1 乳疾清合劑延胡索在紫外光（365 nm）下的薄層色譜圖

2.1.2 玄參取乳疾清合劑80 mL，加水飽和的正丁醇溶液振搖提取2 次，每次30 mL，合并正丁醇液，續用氨水洗滌2 次，每次20 mL，合并正丁醇部分的溶液，用正丁醇飽和的水溶液洗滌2 次，每次20 mL，合并正丁醇部分的溶液并置水浴鍋蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取玄參對照藥材1 g，加水飽和的正丁醇溶液20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液用氨試液洗滌2 次，每次20 mL，合并正丁醇部分的溶液，用正丁醇飽和的水洗滌2 次，每次20 mL，合并正丁醇部分的溶液并置水浴鍋蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為玄參對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（6∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照樣品無干擾，見圖2。

圖2 乳疾清合劑玄參在日光下薄層色譜圖

2.1.3 青皮取“2.1.2”項下供試品溶液作為本項的供試品溶液。另取青皮對照藥材0.3 g，加水飽和的正丁醇溶液20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液用氨試液洗滌2 次，每次20 mL，合并正丁醇部分的溶液，用正丁醇飽和的水溶液洗滌2 次，每次20 mL，合并正丁醇部分的溶液并置水浴鍋蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為青皮對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13）為展開劑，展至約3 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20∶10∶1∶1）的上層溶液為展開劑，展至約8 cm，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點，見圖3。

圖3 乳疾清合劑青皮在紫外光（365 nm）下薄層色譜圖

2.2 微生物限度檢查

2.2.1 菌液制備參照《中華人民共和國藥典》2015 年版四部通則中關于微生物限度檢查方法，分別將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌接種至胰酪大豆胨液體培養基上，在30～35℃下培養18～24 h，然后用pH 為7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液將上述細菌培養液配制成適宜濃度的菌懸液。將黑曲霉接種至沙氏葡萄糖液體培養基，20～25℃培養5～7天，然后取3～5 mL 預先配好的含有0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，其中加入黑曲霉培養液，將孢子洗脫，吸出孢子菌液至滅菌試管內，制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。將白色念珠菌接種至沙氏葡萄糖液體培養基，20～25℃下培養2～3天，然后將白色念珠菌培養液加入到0.9%無菌氯化鈉溶液中，制成適宜濃度的菌懸液。

2.2.2 供試品溶液制備以乳疾清合劑作為供試液。

2.2.3 需氧菌總數、霉菌及酵母菌總數計數

2.2.3.1 對照組菌落數 取供試品溶液1 mL 注入平皿中，傾注加入培養基，待凝結后按照預設定的條件進行培養，計算對照組計數菌落數（A）。

2.2.3.2 試驗組菌落數 取1 mL供試品溶液，分別加入小于100 CFU的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液、白色念珠菌和黑曲霉菌菌液，混勻后在其中傾注加入培養基，待凝結后，按照預設定的條件進行培養，計算試驗組菌落數（B）。

2.2.3.3 菌液組 分別取小于100 CFU的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液、白色念珠菌和黑曲霉菌菌液直接注入培養皿中，然后傾注加入培養基，待凝結后，按照預設定的條件進行培養，計算菌液組菌落數（C）。

2.2.3.4 回收試驗 3 批乳疾清合劑的回收試驗結果表明試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液組菌落數的比值均在0.5～2 范圍內，符合有關規定，見表1。

表1 乳疾清合劑的需氧菌總數、霉菌及酵母菌總數計數方法驗證的回收試驗比值

2.2.4 控制菌檢查由于乳疾清合劑的處方中含有雞內金、全蝎等動物組織，按照《中華人民共和國藥典》2015 年版相關規定，控制菌檢查需要檢查大腸埃希菌和沙門菌。

2.2.4.1 大腸埃希菌檢查 1）供試液組：取“2.2.2”項下供試品溶液10 mL，加入pH 為7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 mL，搖勻后取10 mL 稀釋液加入到100 mL 胰酪大豆胨液體培養基中，30～35℃培養18～24 h。2）試驗組：取“2.2.4.1”項下稀釋液10 cm加入到100 mL胰酪大豆胨液體培養基后，再取小于100 CFU的大腸埃希菌菌液加入到培養基中，30～35℃培養18～24 h。3）菌液組：取小于100 CFU的大腸埃希菌菌液加入到胰酪大豆胨液體培養基中，30～35℃培養18～24 h。4）取上述3 個試驗組的培養物1 mL 接種于100 mL 的麥康凱液體培養基中，42～44℃培養24～48 h。再將所得培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基中，30～35℃中培養18～72 h，判斷是否有大腸埃希菌生長。見表2。

2.2.4.2 沙門菌檢查 1）供試液組：取“2.2.2”項下供試品溶液10 mL，加入胰酪大豆胨液體培養基稀釋至200 mL，搖勻后，30～35℃培養18～24 h。2）試驗組：取“2.2.2”項下供試品溶液10 mL，加入胰酪大豆胨液體培養基稀釋至200 mL，搖勻后，再取小于100 CFU的沙門菌菌液加入到培養基中，搖勻，30～35℃培養18～24 h。3）菌液組：取小于100 CFU 的大腸埃希菌菌液加入到200 mL 胰酪大豆胨液體培養基中，30～35℃培養18～24 h。4）取上述3 組的培養物0.1 mL 接種于10 mL 的RV 沙門菌增菌液體培養基中，30～35℃培養18～24 h。再將所得培養物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基中，30～35℃中培養18～48 h，判斷是否有沙門菌生長。見表2。

表2 乳疾清合劑的控制菌檢查方法驗證結果

3 討論

3.1 薄層鑒別乳疾清合劑的制作工藝較為簡單，直接經過飲用水提取、濃縮、加入輔料后即得，因而使得乳疾清合劑含有多種化學成分。在本研究中建立的薄層色譜法［3］鑒別乳疾清合劑中的延胡索、青皮兩種成分的方法，分別參考了《中華人民共和國藥典》2015 年版中延胡索藥材和青皮藥材的薄層鑒別方法［4］。關于玄參的薄層鑒別方法，筆者曾試用過不同的展開劑：1）以三氯甲烷-甲醇-水（12∶4∶1）的下層溶液作為展開劑；2）以三氯甲烷-甲醇（6∶1）為展開劑。結果發現樣品與對照藥材在相同位置上均顯相同顏色的斑點，且陰性均無干擾，但考慮到方法1）的Rf 較為適中，而且展開劑配制步驟略為簡便，因此選擇了三氯甲烷-甲醇（6∶1）為展開劑。

玄參主要含有環烯醚萜苷類化合物［5］，而該類化合物偏于親水性，易溶于水和甲醇，可溶于正丁醇，而且易被酸水解。而青皮的主要化學成分為橙皮苷，屬二氫黃酮苷類化合物，微溶于甲醇，但可溶于乙醇和正丁醇［6］，因此本研究建立的薄層鑒別法鑒定乳疾清合劑中的玄參、青皮兩種成分的方法，采用相同的供試品溶液制備方法，簡化了在實際檢驗操作中的步驟。

3.2 微生物限度檢查在微生物限度檢查方法學驗證的過程中，為確認供試品中的微生物能被充分檢出，首先應選擇最低稀釋級的供試液進行計數方法實用性檢查［7］。而經實驗發現，乳疾清合劑的需氧菌總數、霉菌及酵母菌總數計數方法和沙門菌檢查方法中，可直接取乳疾清合劑原液進行檢查。而大腸埃希菌的限量檢查，則需要使用稀釋10倍的乳疾清合劑進行檢查。

實驗結果表明，3 批乳疾清合劑的需氧菌總數、霉菌及酵母菌總數的計數方法可行，其回收試驗結果顯示試驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液組菌落數比值在0.5～2 范圍內，且控制菌檢查方法可行，均未檢出大腸埃希菌和沙門菌，符合《中華人民共和國藥典》2015 年版中關于非無菌產品的微生物限度規定。

綜上所述，本實驗建立的乳疾清合劑中延胡索、玄參和青皮的薄層鑒別方法和微生物限度檢查方法，專屬性強，可作為該制劑質量標準的項目之一。