上海地區NRAS基因突變檢測室間質量評價分析*

黃中強，肖艷群，王雪亮，楊依綃，蔣玲麗，周 靖

上海市臨床檢驗中心分子生物學室，上海 200126

神經母細胞瘤病毒癌基因RAS同源物(NRAS)基因是RAS基因家族的主要基因之一，屬于細胞內信號傳導蛋白類原癌基因。當NRAS基因發生突變時，會降低RAS蛋白水解三磷酸鳥苷轉化為二磷酸鳥苷的能力，繼而引起下游通路的改變，致使細胞產生惡性增殖[1-2]。使NRAS基因處于激活狀態的突變主要位于第2、3、4外顯子上，且多見于黑色素瘤、急性髓系白血病和結直腸癌[3]。臨床研究發現NRAS基因突變的結直腸癌患者不能夠從表皮生長因子受體(EGFR)治療中獲益[4]，因此在《中國結直腸癌診療規范(2020年版)》中再次推薦對患者進行NRAS基因突變檢測，以指導腫瘤靶向用藥[5]。當前NRAS基因突變檢測在臨床中已廣泛開展，常用的檢測方法有擴增阻滯突變系統(ARMS)、Sanger測序、高通量測序(NGS)等[6]。多項研究發現，不同實驗室間EGFR、鼠類肉瘤病毒癌基因、鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌基因同源體B和磷脂酰肌醇激酶-3催化亞單位α基因突變檢測結果的一致性較差[7-10]，但目前國內有關NRAS基因突變檢測能力的評估報道較少。因此，本研究擬通過開展NRAS基因突變檢測的室間質量評價(EQA)，以期發現臨床實驗室相關項目存在的問題，進一步改善和提高其檢測質量。

1 材料與方法

1.1標本制備 標本購自菁良基因科技(深圳)有限公司，由具有特定NRAS基因突變型(G12D、G12V、G13D、Q61K、K177N、A146T)的標本和野生型細胞混合后，經甲醛溶液固定、石蠟包埋(FFPE)制備，突變型標本的突變比例約為50%。每支標本管中放有1卷蠟片，組織厚度在15～20 μm，于2～8 ℃冰箱保存。

1.2儀器與試劑 ABI7500熒光定量PCR儀、NanoDrop One超微量紫外分光光度計購自美國Thermo Fisher Scientific公司；人類NRAS基因突變檢測試劑盒購自廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司；FFPE DNA核酸提取試劑盒購自德國Qiagen公司。

1.3標本分析

1.3.1標本驗證 使用NRAS基因突變核酸檢測試劑盒對EQA標本進行驗證，確保標本含有預期NRAS基因型。

1.3.2均勻性與穩定性評價 參照《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》中關于均勻性和穩定性的評價要求[11]，每批EQA標本隨機抽取某個突變型標本10支，使用NRAS基因突變檢測試劑盒進行檢測，完成均勻性評價；在參評實驗室上報結果后的3 d內，隨機抽取2～8 ℃冰箱保存的某個基因型EQA標本6支，使用NRAS基因突變檢測試劑盒進行檢測，完成同步穩定性評價。

1.4EQA的實施 于2019年5月和2020年5月向各參評實驗室發放2次EQA標本盤，每套標本盤包含5支標本，其中突變型標本4支，野生型標本1支。為防止參評實驗室串通數據，每套標本盤的標本進行隨機編號。標本盤經冷鏈運輸至各參評實驗室，要求其在規定時間內用實驗室常規檢測系統檢測，并在2周內將結果通過網絡系統上報至上海市臨床檢驗中心數據庫。

1.5結果評價與分析 根據各實驗室的回報結果計算各參評實驗室得分，預期結果：野生型標本不被檢測為突變型，突變型標本不被檢測為野生型或其他突變型。回報結果與預期結果相符的得20分，不符的得0分，實驗室結果≥80分為成績合格，100分為優秀，否則為不合格。另外對檢測結果進行統計分析，計算整體符合率、假陽性率和假陰性率。

2 結 果

2.1EQA標本結果驗證 本實驗室對不同NRAS基因突變型的FFPE標本進行核酸抽提，使用分光光度法測定其基因組 DNA水平，結果顯示不同標本DNA提取量均>1 000 ng，可滿足不同檢測方法對標本的需要量。使用熒光PCR技術對所提取的核酸進行檢測，結果證實不同標本含有預期NRAS基因型。見圖1。

注：NEG為陰性對照。圖1 NRAS EQA標本的RT-PCR擴增曲線圖

2.2均勻性與穩定性評價 隨機抽取10支G13D突變的FFPE標本進行均勻性檢測，檢測結果均為預期NRAS突變型，這表明EQA標本均勻性良好。在參評實驗室上報結果后的3 d內對隨機抽取的6支G13D突變的FFPE標本進行同步穩定性檢測，結果均為預期NRAS突變型，表明標本具有良好的穩定性，可以滿足EQA標本的要求。見圖2、3。

注：POS為陽性對照；NEG為陰性對照。圖2 NRAS EQA標本均勻性檢測的RT-PCR擴增曲線圖

注：POS為陽性對照；NEG為陰性對照。圖3 NRAS EQA標本穩定性檢測的RT-PCR擴增曲線圖

2.3參評實驗室整體回報情況 2019年和2020年參加NRAS基因突變檢測EQA的實驗室分別有37家和25家，在規定時間內收到的有效回報結果分別為26份和24份，有效回報率分別為70.27%、96.00%。2019年收到有效回報結果的參評實驗室有26家，其中醫院病理科11家，醫學檢驗所15家；2020年收到有效回報結果的參評實驗室有24家，其中病理科12家，醫學檢驗所12家。在兩次EQA中，參評實驗室中最常用的方法為ARMS法，2019年占57.69%，2020年占66.67%，見表1。

2.4EQA結果評價 2019年和2020年兩次EQA回報結果總體合格的實驗室分別占84.62%、95.83%，結果完全正確的實驗室分別占80.77%、79.17%，結果不合格的實驗室分別占15.38%、4.17%。見表1。

表1 參評實驗室檢測方法和檢測能力匯總[n(%)]

2019年和2020年兩次EQA標本整體符合率分別為93.08%、93.33%，假陽性率分別為2.31%、1.67%，假陰性率分別為4.62%、5.00%。在2019年EQA中，有9支標本出現結果與預期結果不符的情況，其中G12D突變標本的符合率最低，為88.46%；在錯誤的結果中，6支標本檢測結果為野生型，假陰性率為66.67%。在2020年EQA中，有8支標本出現與預期結果不符的情況，其中G13D突變標本的符合率最低，為87.50%；在錯誤的結果中，6支標本檢測結果為野生型，假陰性率為75.00%。見表2。

表2 NRAS基因突變檢測標本組成及符合率匯總[n(%)]

3 討 論

近些年來，針對特定靶點的分子靶向藥物越來越多地被應用于臨床，極大地改善了腫瘤患者的預后，延長了生存時間[12]，但NRAS基因突變的腫瘤患者不能夠從EGFR治療中獲益[4]，因此NRAS基因作為腫瘤靶向藥物治療的重要預測因子，準確地檢測NRAS基因狀態對于腫瘤患者的精準治療及減少患者負擔具有至關重要的意義[13-14]。為了全面了解本地區臨床實驗室NRAS基因突變檢測項目的檢測質量，本中心組織實施了EQA活動。

本研究2019年和2020年兩次EQA結果顯示，ARMS法是目前實驗室最常用的檢測方法，在兩次EQA中分別占57.69%、66.67%，這與ARMS法的特異性強、靈敏度高和簡單易操作的優點緊密相關[15]。兩次EQA成績合格的實驗室分別占84.62%、95.83%，說明參評實驗室的檢測能力有所提高。

兩次EQA中，假陰性結果為主要的錯誤類型，在兩次EQA錯誤類型中分別占66.67%、75.00%。2017年英國分子遺傳學會對英國RAS基因EQA的分析結果同樣顯示，NRAS基因突變檢測的主要錯誤類型是假陰性結果[6]，而假陰性結果會導致腫瘤患者可能接受非必要治療，這將對患者造成不良影響。本研究中出現假陰性結果的實驗室使用的方法均為Sanger測序法和NGS法，需要指出的是，在2020年的EQA中，1家實驗室出現了4例假陰性結果，其檢測方法為Sanger測序法，所用試劑為實驗室自配試劑，因此筆者推測導致假陰性結果的主要原因很可能與實驗室自建方法(LDTs)未涉及相關基因位點或未經充分的性能確認有關[16]。另外，假陽性結果在兩次EQA錯誤類型中分別占33.33%、25.00%，主要原因推測為人員操作不規范所致。因此，實驗室應進一步強化人員操作培訓并嚴格按照標準操作程序進行操作，對于使用LDTs的實驗室，必須經過充分性能確認，避免假陽性和假陰性的情況發生。在對實驗室回報結果進行分析時，未發現同一家實驗室連續兩次出現錯誤結果類型，這也表明實驗室可通過加強質量管理工作提高其檢測能力。

基于組織標本的分子病理檢測EQA項目，最合適的檢測標本為臨床組織標本，但由于來源有限及組織的異質性等限制，細胞系和質粒DNA等不同類型的標本均可用于EQA計劃[17]，其中細胞系制備的FFPE標本具有諸多優點，如易于大批量培養制備、可充分模擬臨床標本、可對檢測全過程進行監控等；此外，細胞系標本也可制備含有不同突變比例的FFPE標本。因此，本研究選用細胞系制備的含有NRAS基因主要突變位點的FFPE標本組織EQA活動。發放的標本除了均勻性和穩定性可滿足EQA活動的要求外，也可同時對檢測全過程進行監控，并且能最大限度地模擬臨床組織標本用于EQA活動，但本研究未發放低突變頻率和不同突變頻率的標本，因此后續將深入探討不同頻率標本的影響。

綜上所述，本研究結果表明本地區大部分實驗室NRAS基因突變檢測能力較好，但部分實驗室檢測能力尚需提高。此外，EQA活動可以持續改進實驗室的檢測質量，各實驗室應加強質量管理工作，為臨床精準用藥和治療提供更準確的指導和幫助。