膿毒癥患兒外周血miR-146a、miR-223的表達及與預后的關系*

王 琳，高 潔△，耿 芳

河北省唐山市婦幼保健院：1.病案科；2.檢驗科，河北唐山 063000

膿毒癥是一類常見的全身炎癥反應綜合征，其主要病理過程為在感染、創傷等因素作用下體內炎癥因子及趨化因子水平升高，導致機體處于過度免疫反應狀態，造成機體在清除病原體過程中對自身組織、器官也產生一定損傷[1-3]。流行病學資料顯示，每年約有1 800萬例新發膿毒癥患者，部分患者甚至進展為膿毒癥休克、多器官功能衰竭，嚴重威脅患者生命健康[4-6]。隨著社會的發展，人們生活方式的改變，膿毒癥發病率呈逐年上升趨勢，給家庭乃至社會帶來沉重負擔[7]。目前，微生物培養為膿毒癥診斷的金標準，但該方法存在耗時較長、準確率不高等缺點[8]，因此，探討生物學指標用于膿毒癥患兒病情嚴重程度判斷及預后評估，有十分重要的臨床意義。微小RNA(miRNA)是一類內源性非編碼小RNA分子，其可以通過調節機體基因表達抑制炎癥反應等過程[9]。miRNA在細胞增殖、凋亡、分化等過程中發揮重要作用。有研究表明，miRNA可作為生物標志物用于疾病的診斷及預后評估[10]。miR-146a可影響機體炎癥反應，已廣泛運用于炎癥反應疾病的診斷及評估中[11]。也有研究證實，miR-223在膿毒癥患者炎癥反應過程中發揮重要作用[12]。基于此，本研究通過探討膿毒癥患兒外周血miR-146a、miR-223的表達及與預后的關系，旨在為臨床上診治膿毒癥患兒提供相關依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月至2021年1月本院收治的93例膿毒癥患兒為膿毒癥組，其中男53例，女40例；平均年齡(1.93±0.34)歲。選取同期于本院進行體檢的93例體檢健康兒童為對照組，其中男57例，女36例；平均年齡(1.95±0.28)歲，兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義，具有可比性。膿毒癥患兒納入標準：(1)符合《膿毒癥與感染性休克的國際共識》第三版相關診斷標準[13]；(2)重癥監護室住院時間≥48 h；(3)入院時急性生理與慢性健康(APACHEⅡ)評分>12分；(3)臨床資料完整；(4)年齡≤12周歲。排除標準：(1)入院時接受抗感染治療者；(2)合并免疫缺陷疾病者；(3)合并其他感染性疾病者；(4)依從性差者。本研究經本院醫學倫理委員會批準，患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2方法 所有研究對象于入組時抽取靜脈血7 mL，分成2管，1管2 mL，1管5 mL，2 mL那管以3 000 r/min離心5 min，分離血清，采用散射比濁法檢測C-反應蛋白(CRP)水平(儀器購自深圳普門科技有限公司)，采用上轉換發光技術(儀器購自北京熱景生物)檢測降鈣素原(PCT)水平，試劑均購自唐山惠康生化免疫試劑有限公司；5 mL那管采用RNA提取試劑盒提取外周全血RNA，并根據反轉錄試劑盒進行反轉錄，根據SYBR實時熒光定量(qPCR)試劑盒(購自中國杭州博日科技有限公司)說明書進行qPCR。反應體系為95 ℃預變性30 s，95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，循環35次。采用2-ΔΔCt法計算各組miR-146a和miR-223相對表達水平，U6為內參，每個標本重復3次，取平均值。引物由中國北京鼎國生物科技有限公司合成，miR-146a上游引物序列為5′-CGGATCCTTGGTCTCCTCCAGATGTTTAT-3′，下游引物序列為5′-CCTCGAGTCATTAAAGTGATTTCTCCCAA G-3′；miR-223上游引物序列為5′-GCGCTGTCAGTTTGTCAAATACCC-3′，下游引物序列為5′-CGAATACCTCGGACC-3′；U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列為見5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

膿毒癥組于入院時進行APACHEⅡ評分及序貫器官衰竭(SOFA)評分，并根據APACHEⅡ評分將膿毒癥組患兒分為輕度組(42例)、中度組(29例)和重度組(22例)。APACHEⅡ評分包括急性生理評分、年齡評分及慢性健康評分3方面，分值越高代表患者預后越差[14]。SOFA評分主要內容為對患兒以連續的形式進行單個器官功能評價，分值越高代表患兒預后越差。隨訪28 d根據膿毒癥患兒存活情況分為存活組(69例)和死亡組(24例)。

1.3觀察指標 比較兩組一般資料、CRP、PCT、miR-146a、miR-223水平；比較存活組和死亡組miR-146a、miR-223、CRP及PCT水平，并采用受試者工作特征(ROC)曲線分析miR-146a、miR-223、CRP及PCT水平在評估患者預后中的臨床價值。比較膿毒癥患兒中輕、中、重度組上述指標水平，并采用Pearson相關分析膿毒癥患兒miR-146a、miR-223水平與CRP、PCT水平及APACHEⅡ評分、SOFA評分的相關性。

2 結 果

2.1兩組各指標水平比較 與對照組比較，膿毒癥組外周血miR-146a、miR-223 mRNA水平及血清CRP、PCT水平升高(P<0.05)，見表1。

表1 兩組各指標水平比較

2.2不同病情程度膿毒癥患兒各指標水平比較 與輕度組比較，中度組和重度組膿毒癥患兒外周血miR-146a、miR-223 mRNA水平及血清CRP、PCT水平升高(P<0.05)；與中度組比較，重度組膿毒癥患兒外周血miR-146a、miR-223 mRNA水平及血清CRP、PCT水平升高(P<0.05)，見表2。

表2 不同病情程度膿毒癥患兒各指標水平比較

2.3膿毒癥患兒的miR-146a、miR-223水平與CRP、PCT水平及APACHE Ⅱ評分、SOFA評分的相關性分析 膿毒癥患兒的miR-146a、miR-223水平與CRP、PCT水平及APACHE Ⅱ評分、SOFA評分均呈正相關(P<0.05)，見表3。

表3 膿毒癥患兒的miR-146a、miR-223水平與CRP、PCT水平及APACHE Ⅱ評分、SOFA評分的相關性分析

2.4存活組和死亡組miR-146a、miR-223、CRP及PCT水平比較 與存活組比較，死亡組miR-146a、miR-2233、CRP及PCT水平升高(P<0.05)，見表4。

表4 存活組和死亡組miR-146a、miR-223、CRP及PCT水平比較

2.5miR-146a、miR-223、CRP及PCT水平在評估膿毒癥患兒預后中的臨床價值 miR-146a最佳臨界值為4.837，其在評估患兒預后的AUC為0.898；miR-223最佳臨界值為12.362，其在評估患兒預后的AUC為0.875；CRP最佳臨界值為39.391 mg/L，其評估患兒預后的AUC為0.654；PCT最佳臨界值為3.197 ng/mL，其評估患兒預后的AUC為0.714，見表5、圖1。

表5 miR-146a、miR-223、CRP及PCT水平在評估患兒預后中的臨床價值

圖1 ROC曲線結果

3 討 論

膿毒癥的本質為機體對病原體的免疫反應引起過度炎癥反應，進而導致自身組織器官的損傷。研究表明，臨床對膿毒癥的診斷延遲、病情及預后評估不準確將導致膿毒癥患者病死率升高，因此早期治療及對病情進行有效評估具有十分重要的臨床意義[8]。

膿毒癥患者體內會釋放大量炎癥因子，而這一類炎癥因子可促進機體抵御病原體的侵襲，但當炎癥因子水平過度表達時又會引起免疫反應的失衡，導致免疫功能紊亂。目前，臨床上采用部分炎癥因子作為評估病情的輔助指標之一。PCT主要由甲狀腺C細胞分泌，正常生理條件下，PCT水平極低，而一旦患者發生感染時，肝臟巨噬細胞及單核細胞在內毒素等因素的刺激下，機體大量分泌PCT，導致血清PCT水平升高，并在感染12～24 h時達到峰值[15-16]。CRP是一類急性時相反應蛋白，具有出現時間早，水平升高迅速等特點。當機體發生感染性疾病時，CRP水平將會出現不同程度的升高。研究表明，CRP作為檢測機體炎癥反應的敏感性指標，當機體發生感染時，其水平將升高，且水平變化往往不受放化療藥物及激素類藥物的影響[17-18]。本研究結果顯示，相較于健康兒童，膿毒癥患兒CRP、PCT水平均有所升高。但研究表明，PCT水平升高主要由細菌性感染或細菌釋放的內毒素和炎癥因子所致，而機體發生病毒性感染或在其他因素刺激下往往并不會引起PCT水平升高，而膿毒癥往往也受病毒感染影響[15]。此外CRP在自身免疫性疾病、燒傷等情況下水平也有所升高，具有特異性較差的缺點[17-18]。因此將PCT或CRP作為膿毒癥的生物標志物往往存在各自的缺點，難以獲得較好的效果。筆者進一步發現，相較于存活組，死亡組PCT及CRP水平均有所升高，但CRP及PCT水平在評估患者預后中的AUC<0.8，且靈敏度及特異度不高。這也進一步說明CRP及PCT作為膿毒癥的生物標志物中存在一定不足。

miRNA是一類內源性非編碼小RNA分子，可調控細胞分化、增殖、凋亡、代謝等生物學過程，且其水平異常往往與炎癥反應及免疫調節等過程密切相關[9]。miR-146a為miRNA家族成員之一，既往研究發現，在miR-146a與巨噬細胞極化存在密切聯系，在巨噬細胞抵抗病原菌入侵的炎癥反應過程中，miR-146a呈過表達[19]。已有研究證實，miR-146a可能參與膿毒癥的發生發展[20]。侯果等[21]的研究發現，相較于健康人群，膿毒癥患者外周血miR-146a水平升高，本研究也得到較為一致的結論。此外，本研究還發現，隨著患者病情嚴重程度的增加，其外周血miR-146a水平也有所升高，且miR-146a水平與CRP、PCT水平及APACHEⅡ評分、SOFA評分均呈正相關，這也提示膿毒癥患者miR-146a水平升高，并與患者病情程度及炎癥反應程度密切相關。miR-223為近年來發現的一類位于X染色體上的miRNA，其在骨髓譜系中呈特異性表達，既往已有研究報道了miR-223可作為生物標志物用于疾病的診斷及病情評估[22]。還有研究證實，miR-223與機體造血功能、免疫反應等過程密切相關，并可調節機體炎癥反應，并提示miR-223可能參與膿毒癥的發生發展[23]。本研究結果顯示，相較于健康兒童，膿毒癥患兒miR-223水平升高，并與患者病情程度及炎癥反應程度密切相關，這也進一步證實miR-223參與膿毒癥的發生發展。本研究也通過ROC曲線分析了miR-146a和miR-223在評估膿毒癥患兒預后中的臨床價值，結果顯示，miR-146a最佳臨界值為4.837，其在評估患兒預后中的AUC為0.898；miR-223最佳臨界值為12.362，其在評估患兒預后中的AUC為0.875，提示miR-146a和miR-223在評估膿毒癥患兒預后中均具有一定的臨床價值。

綜上所述，膿毒癥患兒miR-146a、miR-223、PCT、CRP水平升高，并與患兒病情嚴重程度及炎癥反應密切相關，miR-146a、miR-223水平在評估膿毒癥患兒預后中均具有一定臨床價值，但PCT及CRP水平在評估患兒預后中的臨床價值并不顯著。但本研究也存在以下不足：(1)未動態觀察各指標變化情況，難以獲得連續性資料；(2)研究所納入樣本量較少，且樣本來源為單中心。因此，后續仍需多中心、大樣本的研究進一步加以證實。