老年性白內障患者晶狀體上皮細胞CNN3、YAP表達與晶狀體上皮細胞凋亡的相關性研究*

王 喆，王 敏，楊順玲，梁 娜，黃 帥

河北省邯鄲市眼科醫院/河北省邯鄲市第三醫院眼科，河北邯鄲 056001

白內障是由遺傳、免疫等原因引起晶狀體蛋白變性而發生渾濁的一種眼部疾病，其主要臨床表現為單側或雙側晶狀體渾濁、視物不清晰等，中老年人為多發群體，發病率隨年齡增大而升高。但白內障發病機制至今尚未完全明確，研究表明，晶狀體的生長涉及上皮細胞的增殖及分化，而細胞生長分化受多種信號因子和機制的調節[1-2]。鈣調節蛋白3(CNN3)是一種肌動蛋白結合蛋白，在神經系統發育、胚胎發育、肌細胞生成和細胞融合過程中發揮重要作用[3]。研究表明，CNN3是眼發育所需要的同源盒蛋白(OTX2)轉錄因子的下游靶基因[4]。Yes相關蛋白(YAP)是Hippo信號通路相關因子，在細胞生長發育凋亡過程中發揮作用，研究表明，Hippo/YAP通路在調控晶狀體細胞生長中起重要作用[5-6]。何章彪等[7]研究表明，在大鼠晶狀體上皮細胞中，成纖維細胞生長因子(FGF)誘導的核YAP表達在促進晶狀體上皮細胞增殖中發揮重要作用，抑制YAP后，可顯著抑制FGF誘導的晶狀體細胞增殖。但是CNN3、YAP在白內障中的確切作用機制尚不明確。本研究檢測老年性白內障晶狀體上皮細胞中CNN3、YAP信使核糖核酸(mRNA)和蛋白的表達情況，分析CNN3 mRNA、YAP mRNA表達水平與晶狀體上皮細胞凋亡的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年2月至2021年9月本院收治的老年性白內障患者67例作為老年性白內障組，所有患者均接受手術治療，留取晶狀體前囊膜標本，其中男37例，女30例；年齡58～76歲，平均(62.80±8.71)歲；病程2～5年，平均(3.50±1.20)年。納入標準：(1)患者均符合老年性白內障診斷標準[8]；(2)最佳矯正視力≥0.5，角膜散光<1.00 D；(3)未患有青光眼、視神經炎、眼部發炎等其他眼部疾病。排除標準：(1)患其他類型白內障、外傷等眼部疾病者；(2)合并高血壓、糖尿病及其他繼發性視力減退疾病者；(3)合并認知障礙或精神疾病患者。另選取同期于本院進行角膜移植術并排除白內障的患者42例為對照組，其中男25例，女17例；年齡56～75歲，平均(61.90±8.63)歲。老年性白內障組和對照組性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經本院醫學倫理委員會批準，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 Trizol試劑盒(批號BJK1596)、反轉錄試劑盒(批號BJK1813)、實時熒光定量PCR(qPCR)試劑盒(批號BJS8023)、兔抗人CNN3(批號ab204365)、YAP(批號ab52771)、β-肌動蛋白(β-actin，批號ab30157)單克隆抗體、鼠抗人二抗(批號ab90073)均購自美國Abcam公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(批號C1071S)購自南京立喬生物科技有限公司；qPCR儀(型號ProFlex)、蛋白免疫印跡成像系統(型號CL1500)、流式細胞儀(型號CJ1900)均購自深圳市德誠儀器科技有限公司。

1.3方法

1.3.1標本采集及保存 收集老年性白內障組與對照組患者的晶狀體前囊膜(晶狀體前囊膜主要由上皮細胞構成)，直徑約6 mm，生理鹽水沖洗后立即置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2qPCR法檢測晶狀體上皮細胞中CNN3 mRNA、YAP mRNA表達 應用Trizol試劑盒提取晶狀體上皮細胞中的總RNA，反轉錄合成cDNA，采用qPCR試劑盒合成反應體系然后進行擴增，CNN3 mRNA、YAP mRNA和內參基因β-actin引物序列由北京奧科生物技術有限責任公司合成，引物序列見表1。反應條件：95 ℃ 90 s；94 ℃ 60 s，62 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，38個循環。反應結束后，CNN3 mRNA、YAP mRNA表達水平采用2-ΔΔCt法計算，每個標本重復3次，取平均值。

表1 引物序列

1.3.3蛋白免疫印跡法檢測晶狀體上皮細胞中CNN3、YAP蛋白表達 在晶狀體上皮細胞中加入裂解液裂解30 min后，以12 000 r/ min離心30 min，取上清液，經電泳后轉膜，10%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗CNN3、YAP和β-actin(稀釋濃度1∶500)，4 ℃孵化過夜，TBST洗膜3次，再加入鼠抗人二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，使用ECL顯色液顯色，以β-actin為內參，對各條帶進行灰度分析，以相對灰度值表示蛋白表達水平。

1.3.4流式細胞儀檢測晶狀體上皮細胞凋亡 晶狀體上皮細胞經胰蛋白酶消化后，調整細胞濃度為每毫升1×105個，使用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2 結 果

2.1對照組和老年性白內障組晶狀體上皮細胞中CNN3 mRNA、YAP mRNA表達水平比較 與對照組比較，老年性白內障組晶狀體上皮細胞中CNN3 mRNA表達水平升高，YAP mRNA表達水平降低(P<0.05)，見表2。

表2 對照組和老年性白內障組晶狀體上皮細胞中CNN3mRNA、YAP mRNA表達水平比較

2.2對照組和老年性白內障組晶狀體上皮細胞中CNN3、YAP蛋白表達水平比較 與對照組比較，老年性白內障組晶狀體上皮細胞中CNN3蛋白表達水平升高，YAP蛋白表達水平降低(P<0.05)，見圖1、表3。

表3 對照組和老年性白內障組晶狀體上皮細胞中CNN3、YAP蛋白表達水平比較

圖1 對照組和老年性白內障組晶狀體上皮細胞中的CNN3、YAP蛋白印跡圖

2.3老年性白內障患者晶狀體上皮細胞中CNN3 mRNA與YAP mRNA表達水平相關性分析 老年性白內障患者晶狀體上皮細胞中CNN3 mRNA與YAP mRNA表達水平呈負相關(r=-0.658，P<0.001)。

2.4對照組和老年性白內障組晶狀體上皮細胞凋亡率比較 老年性白內障組晶狀體上皮細胞凋亡率為(16.72±3.43)%，高于對照組的(2.98±0.45)%，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

注：A為對照組；B為老年性白內障組。圖2 對照組和老年性白內障組晶狀體上皮細胞凋亡流式圖

2.5老年性白內障患者晶狀體上皮細胞中CNN3 mRNA、YAP mRNA表達水平與晶狀體上皮細胞凋亡率的相關性分析 老年性白內障患者晶狀體上皮細胞中CNN3 mRNA表達水平與晶狀體上皮細胞凋亡率呈正相關(r=0.414，P<0.001)，YAP mRNA表達水平與晶狀體上皮細胞凋亡率呈負相關(r=-0.600，P<0.001)。

3 討 論

白內障是由于晶狀體調節功能失常而引起的晶狀體混濁，由衰老、物理損傷、手術、炎癥及藥物等原因造成，可引起視物困難，給患者生活造成極大不便，白內障常發生于40歲以上人群，發病率與致盲率均居眼部疾病首位[9-10]。目前手術是治療白內障的唯一有效手段，但術中及術后出現的各種并發癥，給患者生活帶來較大困難。因此，研究白內障發生機制，對白內障的診斷和治療具有重要臨床意義[11-12]。

CNN3是肌動蛋白結合分子CNN家族的成員，在平滑肌細胞及大腦神經細胞、星型膠質細胞中均有表達，缺乏CNN3的動物胚胎表現出發育中的大腦大量畸形，包括腦電圖，延髓神經管的閉合缺陷及腦組織的強烈擴張[13-14]。還有研究表明，在細胞增殖過程中，敲除CNN3可導致細胞增殖和遷移減少，在分化過程中，CNN3可通過蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和腺苷酸活化蛋白激酶/mTOR通路抑制老鼠肌肉細胞的肌原性分化、融合和蛋白合成[15]。以上研究表明，CNN3在細胞增殖、發育與分化中起著重要調控作用，本研究結果顯示，老年性白內障組晶狀體上皮細胞中CNN3 mRNA和蛋白表達水平高于對照組，提示CNN3的異常表達可能與老年性白內障的發生相關。

YAP是Hippo信號通路的關鍵下游分子，在多種腫瘤組織中有表達，Hippo信號傳導途徑通過YAP來調節細胞生長、增殖與分化[16-17]。研究表明，YAP在晶狀體上皮細胞增殖和晶狀體纖維分化過程中起著重要作用[18]。另有研究表明，在FGF誘導的大鼠晶狀體上皮外植體中，晶狀體纖維分化與細胞質磷酸化YAP水平升高，抑制YAP可抑制FGF誘導的晶狀體細胞增殖和晶狀體纖維分化過程中的消融細胞伸長[19]。本研究結果顯示，老年性白內障組晶狀體上皮細胞YAP mRNA和蛋白表達水平低于對照組，表明YAP的低表達可能參與老年性白內障疾病的發生。然而CNN3、YAP在老年性白內障中的具體作用機制尚不清楚。

MADDALA等[4]研究表明，CNN3在調節晶狀體上皮表型中發揮重要作用，并揭示了CNN3缺失可引起細胞形態、細胞黏附、極性的改變和收縮活性的增加，從而導致YAP/轉錄共激活因子PDZ結合基序激活和上皮間質轉化。本研究結果顯示，老年性白內障患者晶狀體上皮細胞中CNN3 mRNA與YAP mRNA表達水平呈負相關(P<0.05)，提示CNN3、YAP可能共同參與調控老年性白內障的發生。由于外部損傷、年齡老化等因素會使晶狀體上皮細胞活性降低，YANG等[20]研究顯示，白內障的發生伴隨晶狀體上皮細胞的凋亡。本研究結果發現，老年性白內障組晶狀體上皮細胞凋亡率高于對照組，提示晶狀體上皮細胞凋亡可能與老年性白內障疾病的發生有關。相關性分析結果顯示，老年性白內障患者晶狀體上皮細胞中CNN3 mRNA表達水平與晶狀體上皮細胞凋亡率呈正相關，YAP mRNA表達水平與晶狀體上皮細胞凋亡率呈負相關(P<0.05)，提示YAP、CNN3可能通過某種作用機制調節晶狀體上皮細胞凋亡，從而參與老年性白內障疾病的發生發展。

綜上所述，老年性白內障患者晶狀體上皮細胞中CNN3呈高表達、YAP呈低表達，與晶狀體上皮細胞凋亡率有關，CNN3、YAP可能參與老年性白內障疾病的發生。二者在老年性白內障疾病中的具體作用機制尚不清楚，仍需做進一步研究。