肺泡灌洗液中多種生物標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)在呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎早期診斷中的應(yīng)用*

譚家余，麥志偉，楊 博，鐘苑芳，李景姍，羅正超，黃 湘

1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山市博愛(ài)醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室，廣東中山 528403；2.廣東省佛山市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東佛山 528200

肺泡灌洗液(BALF)中生物標(biāo)志物可能有助于各種感染疾病的早期診斷，包括呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎(VAP)。但大多數(shù)研究的生物標(biāo)志物是炎癥標(biāo)志物，缺乏特異性。近年來(lái)，研究表明與VAP有關(guān)的生物標(biāo)志物較多，如巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α、白細(xì)胞介素-1β、粒細(xì)胞集落刺激因子、可溶性髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1(sTREM-1)、聯(lián)啡肽、纖溶酶原激活抑制物-1、穿透素-3(PTX3)、表面活性蛋白D(SP-D)等[1-4]。本課題組既往研究顯示中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶可作為診斷VAP的指標(biāo)之一，且與VAP的轉(zhuǎn)歸有關(guān)[5]。但目前仍缺乏單一的確診VAP的生物標(biāo)志物。為此，本研究擬通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)BALF中降鈣素原(PCT)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、sTREM-1、PTX3和SPD等指標(biāo)，來(lái)探討多個(gè)生物標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)在診斷VAP中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年5月至2021年4月在中山市博愛(ài)醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室進(jìn)行機(jī)械通氣治療的患者587例。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥14歲；特重型顱腦損傷、腦出血、腦梗死、急性左心衰竭、心臟驟停、重度哮喘、急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、重癥胰腺炎等需要呼吸機(jī)支持的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：社區(qū)性肺炎、免疫系統(tǒng)疾病、肺部惡性腫瘤、肺結(jié)核和血液病等；通氣時(shí)間<48 h；中途非VAP死亡；放棄治療；臨床資料不全者。VAP的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎診斷和治療指南(2018年版)》[6]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。VAP患者46例，剔除符合排除標(biāo)準(zhǔn)，中途非VAP死亡和臨床資料不全的患者，VAP組入組40例，同期非VAP組入組48例。本研究經(jīng)該院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法 BLAF采集方法：用纖支鏡把氣道內(nèi)痰吸盡，纖支鏡遠(yuǎn)端送入段支氣管開(kāi)口處，注入生理鹽水10 mL，隨后負(fù)壓吸引，將BLAF吸到無(wú)菌集痰器內(nèi)。以1 500 r/min離心5 min，取上清液保存在-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)待測(cè)。在上機(jī)時(shí)、確診VAP時(shí)和脫機(jī)時(shí)各采集BLAF 1次。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)BALF中CRP、sTREM-1、PTX3、SP-D水平，試劑盒由武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司提供，采用羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)PCT水平，試劑盒由羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司提供，具體步驟按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

收集患者臨床資料，如年齡、性別、體溫、痰量、氧合指標(biāo)、痰細(xì)菌培養(yǎng)、機(jī)械通氣時(shí)間、影像學(xué)結(jié)果和急性生理學(xué)和慢性健康狀況評(píng)價(jià)(APACHE)Ⅱ評(píng)分等。

2 結(jié) 果

2.1兩組一般資料比較 兩組的年齡、性別、APACHEⅡ評(píng)分及病種分類(lèi)等指標(biāo)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2兩組生物標(biāo)志物水平比較 兩組患者上機(jī)時(shí)BALF中生物標(biāo)志物水平(PCT、CRP、sTREM-1、PTX3)均較低，但組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與上機(jī)時(shí)比較，確診VAP時(shí)非VAP組BALF中PTX3水平升高(P<0.05)，但其他生物標(biāo)志物水平變化均不明顯(P>0.05)，而VAP組BALF中生物標(biāo)志物水平均明顯升高(P<0.05)；確診VAP時(shí)，兩組PCT、sTREM-1、SP-D、PTX3水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與確診VAP時(shí)比較，VAP組脫機(jī)時(shí)BALF中生物標(biāo)志物水平均明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組生物標(biāo)志物水平比較[M(P25，P75)]

組別nsTREM-1(ng/mL)上機(jī)時(shí)確診VAP時(shí)脫機(jī)時(shí)SP-D(pg/mL)上機(jī)時(shí)確診VAP時(shí)脫機(jī)時(shí)非VAP組486.33(0.25,17.93)7.81(0.25,25.49)5.44(1.44,13.38)0.16(0.01,0.33)0.16(0.01,0.45)0.12(0.04,0.33)VAP組405.54(3.02,18.79)26.43(5.78,48.00)a9.09(3.85,20.00)b0.22(0.09,0.56)0.52(0.22,1.33)a0.22(0.09,0.56)bZ-0.630-3.178-1.888-2.261-4.221-1.953P0.5280.0010.0590.024<0.0010.051

組別nPTX3(pg/mL)上機(jī)時(shí)確診VAP時(shí)脫機(jī)時(shí)非VAP組4836.02(16.59,71.44)54.50(19.40,208.40)a43.55(19.40,74.50)bVAP組4037.13(12.51,60.27)408.69(193.09,646.50)a40.52(17.42,76.02)bZ-0.855-4.894-0.314P0.393<0.0010.753

2.3各生物標(biāo)志物診斷VAP的價(jià)值分析 結(jié)果發(fā)現(xiàn)BALF中除CRP(AUC為0.546，靈敏度為0.36，特異度為0.80)外，PCT、SP-D、sTREM-1、PTX3診斷VAP均有較高的診斷價(jià)值，AUC分別為0.803、0.762、0.697、0.804，靈敏度分別為0.75、0.78、0.76、0.81，特異度分別為0.78、0.60、0.58、0.60；對(duì)BALF中診斷VAP有意義的4個(gè)生物標(biāo)志物(PTX3、PCT、SP-D、sTREM-1)按AUC由大到小進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同組合的AUC均在0.8以上，說(shuō)明聯(lián)合檢測(cè)能夠增加診斷VAP的準(zhǔn)確性，其中PTX3+PCT+SP-D的AUC最大，為0.868，PTX3+PCT的AUC為0.839，PTX3+PCT+SP-D+sTREM-1的AUC為0.863。見(jiàn)圖1。

圖1 BALF中PCT、SP-D、sTREM-1、PTX3單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷VAP的ROC曲線(xiàn)

3 討 論

VAP是重癥監(jiān)護(hù)室一種常見(jiàn)的與機(jī)械通氣有關(guān)的肺部感染，它的發(fā)生會(huì)加重患者原有病情，影響患者預(yù)后，甚至導(dǎo)致病死率升高，同時(shí)也可延長(zhǎng)患者住院時(shí)間，增加住院費(fèi)用。如何早期診斷VAP，是VAP防治中的重中之重。如能早期發(fā)現(xiàn)，早期治療，可減少治療的成本，改善患者預(yù)后，同時(shí)減少抗菌藥物的盲目使用。但由于VAP患者的臨床癥狀和體征與其他重癥患者相似，而目前尚缺乏快速理想的病原學(xué)診斷靶標(biāo)，治療主要依賴(lài)于經(jīng)驗(yàn)用藥。故尋找可診斷或判斷VAP預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)對(duì)于該病的及時(shí)治療和改善預(yù)后意義重大。

眾所周知，CRP是一個(gè)最常見(jiàn)的炎癥指標(biāo)，與感染性和非感染性疾病均有關(guān)，缺乏特異性。有研究顯示，檢測(cè)BALF中CRP對(duì)VAP的診斷具有一定幫助，特別是動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其變化可以用來(lái)評(píng)估疾病的進(jìn)程[7]。本研究亦發(fā)現(xiàn)VAP組BLAF中CRP水平明顯升高，但與非VAP組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。可能原因是BLAF中CRP要比血清中水平明顯低，變化不明顯，另外，CRP缺乏特異性，患者原發(fā)病也可能引起B(yǎng)LAF中CRP水平升高。PCT是一個(gè)很好的細(xì)菌性感染早期預(yù)測(cè)和療效觀察指標(biāo)，有研究顯示BALF中PCT診斷VAP的靈敏度為55%，特異度為80%，其水平隨疾病的加重而升高、隨疾病好轉(zhuǎn)而降低[8]。但丁磊等[9]研究顯示，在比較VAP組及非VAP組BALF中PCT和CRP水平時(shí)，未發(fā)現(xiàn)明顯差異。本研究則發(fā)現(xiàn)，確診VAP時(shí)，與非VAP組比較，VAP組BALF中PCT水平升高，而且VAP好轉(zhuǎn)后，PCT水平明顯降低(P<0.05)，與SHOKRI等[8]研究類(lèi)似。但是本研究在檢測(cè)BALF中PCT水平時(shí)，盡管采用了目前準(zhǔn)確率比較高的羅氏電化學(xué)發(fā)光法，但所有患者檢測(cè)出的水平均較低，呈非正態(tài)分布，而且數(shù)值變化幅度沒(méi)有血清PCT明顯，是否檢測(cè)血清PCT診確VAP準(zhǔn)確性會(huì)更好，有待進(jìn)一步研究。另外，本研究中BALF標(biāo)本檢測(cè)出的CRP和PCT水平均較低，是否與BALF中分泌不多有關(guān)，或者與標(biāo)本保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)蛋白質(zhì)已經(jīng)分解有關(guān)，值得進(jìn)一步探討。

sTREM-1是一種免疫球蛋白，在肺泡巨噬細(xì)胞中選擇性表達(dá)。自GIBOT等[10]報(bào)道檢測(cè)BLAF中sTREM-1水平可用于VAP的早期診斷以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼進(jìn)行了較多的研究，本課題組近期通過(guò)總結(jié)國(guó)內(nèi)外公開(kāi)發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行Meta分析得出了肺泡液中sTREM-1水平明顯升高，可以作為VAP的早期診斷指標(biāo)的結(jié)論[11]。PTX3也是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，在早期炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。人體肺泡內(nèi)皮細(xì)胞可以在促炎因子的作用下大量合成分泌，因此在VAP發(fā)生時(shí)BALF中可能檢測(cè)到其明顯變化。YE等[12]通過(guò)Meta分析發(fā)現(xiàn)BALF中PTX3診斷呼吸道感染的AUC為0.89，BALF中PTX3的檢測(cè)有助于VAP的早期診斷。SP-D是一種豐富的肺表面活性劑相關(guān)蛋白，在肺的局部防御和免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程中起重要作用。SAID等[3]發(fā)現(xiàn)兒科機(jī)械通氣患兒BALF中SP-D水平明顯升高，而且與不同菌種有關(guān)，其變化先于臨床肺部感染評(píng)分和BALF培養(yǎng)檢測(cè)到的感染。本研究發(fā)現(xiàn)與上機(jī)時(shí)比較，診斷VAP時(shí)VAP組BALF中生物標(biāo)志物水平(SP-D、sTREM-1、PTX3)均明顯升高(P<0.05)。與非VAP組比較，VAP組診斷VAP時(shí)SP-D、sTREM-1、PTX3水平均明顯升高(P<0.05)，VAP臨床治愈后上述標(biāo)志物均明顯降低(P<0.05)。同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)，上述3個(gè)標(biāo)志物在不同患者BALF中變化巨大，均呈非正態(tài)分布，因此數(shù)據(jù)分析時(shí)采用的均是非參數(shù)檢驗(yàn)，這也提示對(duì)這類(lèi)指標(biāo)研究最佳臨界值時(shí)要慎重，不同的標(biāo)本來(lái)源得出的最佳臨界值可能相差很大。

通過(guò)繪制ROC曲線(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，BALF中除CRP外，PCT、SP-D、sTREM-1、PTX3診斷VAP，均有較好的準(zhǔn)確性，AUC分別為0.803、0.762、0.697、0.804。進(jìn)一步對(duì)上述4個(gè)生物標(biāo)志物按AUC由大到小進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同組合的AUC均在0.8以上，其中PTX3+PCT+SP-D組合的AUC最大，為0.868。說(shuō)明聯(lián)合檢測(cè)能夠增加診斷VAP的準(zhǔn)確性。但本研究的樣本量仍較少，采集標(biāo)本的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)結(jié)果有一定影響。下一步宜進(jìn)行多中心研究，統(tǒng)一標(biāo)本采集方法，縮短標(biāo)本采集時(shí)間，增加樣本量，以便得出更有意義的結(jié)論。

綜上所述，本研究提示BALF中PCT、SP-D、sTREM-1、PTX3診斷VAP，均有較好的準(zhǔn)確性，而上述4個(gè)指標(biāo)的不同組合聯(lián)合檢測(cè)均能夠進(jìn)一步增加診斷VAP的準(zhǔn)確性，其中PTX3+PCT+SP-D組合最有意義。