自動化磁珠法標本制備聯合液相色譜串聯質譜檢測人血清中25-羥基維生素D的性能評價

盧 山，董輝苒，任文華，蘇 玉，李春艷，萬極碩，吳 俊

北京積水潭醫院檢驗科，北京 100035

維生素D作為人體必需的營養素，對人體鈣和磷的正常代謝有直接影響。維生素D缺乏十分常見，因此維生素D水平的準確檢測對多種鈣代謝相關疾病的預防和治療有著重要的意義。維生素D在血液循環中的主要形式以25-羥基維生素D[25-(OH)D]呈現，其半衰期最長，濃度最高，且最穩定，能反映人體的維生素D總量。25-(OH)D的主要形式為25-(OH)D2和25-(OH)D3，所以評價體內維生素D營養狀況最為有效的指標是血清中25-(OH)D2和25-(OH)D3水平[1]。

近年來，維生素D的檢測越來越受到人們的重視。國家在2015年發布了血清中25-(OH)D3檢測的行業標準[2]。目前液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)有通用性強、特異度和靈敏度高的優勢，可以同時檢測25-(OH)D2和25-(OH)D3，是國際上維生素D檢測的金標準[3-10]。然而在臨床檢測維生素D的過程中，LC-MS/MS存在的問題是前處理過程復雜。目前多數實驗室是通過手工操作完成加樣和取樣步驟，臨床操作人員需要較高的技能要求，因此容易出現人為失誤導致檢測結果不好。近年來，自動化磁珠法(MSPE)標本制備的出現有望將LC-MS/MS技術發展成為前處理和檢測一體的全自動檢測方法，受到臨床的極大重視，該法前處理過程簡單，可節省人力和時間成本。因此，本研究評估了使用MSPE進行標本前處理后25-(OH)D2和25-(OH)D3的檢測結果，并與液液萃取法(LLE)和傳統固相支撐液液萃取法(SLE)檢測結果進行比較，以期為臨床選擇不同的標本處理方法提供幫助。

1 材料與方法

1.1材料來源 血清標本為當天臨床檢測剩余血清，選取避免溶血、乳糜、黃疸的120份臨床血清標本分裝后于-20 ℃冰箱保存待用。

1.2儀器與試劑 LC-MS/MS系統(美國AB SCIEX)；自動化磁珠法質譜標本前處理系統ZPTQ 32(北京梅斯質譜生物)；低速離心機(北京京立)；微孔板振蕩器、氮吹儀(杭州奧盛儀器)；LLE的25-(OH)D測定試劑盒(江蘇豪思生物)。SLE所用提取板為Cleanert SLE 96Wellplate(天津博納艾杰爾)。MSPE的25-羥維生素D測定試劑盒(北京梅斯質譜生物)。

1.3方法

1.3.1LLE法標本處理過程 按照常規的LLE操作流程進行操作，首先將100 μL標本添加至小型離心管中，再在其中加入100 μL含內標的甲醇，然后添加600 μL乙酸乙酯，震蕩后離心取400 μL上清液，氮吹后用100 μL初始流動相復溶。質控和標準品同步按操作處理。

1.3.2SLE法標本處理過程 SLE法按Cleanert SLE 96Wellplate使用要求進行操作，首先將100 μL標本加入預設的96孔處理板中的標本位置，再在其中加入同位素內標，然后每孔加入100 μL純水稀釋靜置5 min，之后每孔采用1 200 μL正己烷淋洗，收集淋洗液氮氣吹干，用100 μL初始流動相復溶。質控和標準品同步按操作處理。

1.3.3MSPE標本處理過程 按照試劑盒操作規程操作。首先將100 μL標本加入預設的96孔中的標本位置，再在其中加入同位素內標，之后將96孔板轉移至梅斯ZPTQ 32儀器進行自動標本處理。質控和標本同步按操作處理。

1.3.4LC-MS/MS 色譜柱采用Kinetex 2.6 μm C18100A 30×2.1 mm規格，含0.1%甲酸的水溶液為流動相A，以含0.1%甲酸的甲醇為流動相B，采用梯度洗脫：0～<0.3 min，40%流動相A；0.3～<1.5 min，0%～<40%流動相A；1.5～2.5 min，0% 流動相A；2.5～3.5 min，40%流動相A,流速0.5 mL/min。采用正離子大氣壓化學電離離子化的多反應監測模式，25-(OH)D2和25-(OH)D3定量離子通道質荷比分別為395.2∶269.3和383.3∶365.3；定性離子通道質荷比分別為395.2∶337.2和383.3∶257.2；內標離子通道質荷比分別為398.2∶272.3和389.3∶371.3。離子源溫度：500 ℃，離子源電壓5 500 V，氣簾氣30，霧化氣55，輔助氣20。

1.4性能驗證 性能驗證過程參考《液相色譜-質譜臨床應用建議》[11]和《液相色譜串聯質譜臨床檢測方法的開發與驗證》[12]指南。

1.4.1線性、定量限和檢測限評價 以標準溶液濃度為X軸，標準品和內標峰面積的比值為Y軸，進行線性回歸分析，經“1/X2”權重得回歸方程。將樣品待測物和內標的峰面積比代入標準曲線方程，計算標本中25-(OH)D2和25-(OH)D3水平，r>0.99。以信噪比≥3時的濃度設為檢測限，以信噪比≥10時的濃度設為定量限，且連續10次測定的變異偏差<20%。

1.4.2精密度評價 混合血清標本，平均分為2份，其中1份作為低水平標本，另1份添加適量標準品混合物作為高水平標本，將2個水平標本混勻，分裝至凍存管，置于-80 ℃保存。每天各取出1支，制備8個平行管，測定3批次，計算該方法的精密度。

1.4.3絕對回收率評估 取來源于不同患者的血清標本，每份不少于1 mL，震蕩混勻備用。標本再分為空白對照和MSPE提取前加標準品[添加2個10 μL不同濃度標準品，25-(OH)D2為3/13 ng/mL，25-(OH)D3為5/30 ng/mL]和MSPE提取后加標準品[添加2個10 μL不同濃度標準品，25-(OH)D2為3/13 ng/mL；25-(OH)D3為6/30 ng/mL]，最終用水補齊復溶體積。比較磁珠提取前加標準品(去除空白本底)與MSPE提取后加標準品(去除空白本底)峰面積的差異。

1.4.4相對回收率和準確度評估 通過測定混合血清和混合血清添加25-(OH)D2和25-(OH)D3的2個水平混合標準品溶液各10 μL[加入標準品對應理論水平25-(OH)D2為3/13 ng/mL，25-(OH)D3為6/30 ng/mL]，每種處理各制備3個平行管，計算加樣回收率及與預期濃度的偏差。

1.4.5基質效應評估 采用標本處理后加入法。取4份來源于不同個體的血清標本，每份標本分為3份，經過MSPE提取，其中1份加入水，1份加入10 μL標準品25-(OH)D2(3 ng/mL)，25-(OH)D3(6 ng/mL)，另1份加入10 μL標準品 25-(OH)D2(13 ng/mL)，25-(OH)D3(30 ng/mL)，3份均加入10 μL混合內標。標本中去除空白中的信號值后與溶劑中標準品峰面積(或峰面積內標比)進行比較，分析方法的基質效應。

1.4.6方法比對 收集臨床檢測剩余血清標本120例，各待測物濃度在檢測范圍內分布相對均勻，采用LLE、SLE和MSPE同時進行處理，然后采用相同LC-MS/MS方法進行檢測，比較3種提取方法檢測結果的一致性。

1.5統計學處理 采用MedCalc進行統計學分析和作圖，采用Bland&Altaman作圖比較3種方法的差異，以Passing &Bablok回歸分析3種方法之間的相關性。

2 結 果

2.1血清標本經MSPE提取后的典型色譜峰圖 25-(OH)D2和25-(OH)D3的出峰時間分別為1.90 min、1.86 min，兩種待測物峰形對稱，各成分分離良好，互不干擾，且與SLE方法提取后的檢測結果比較，MSPE提取后未發現雜峰明顯增多。

2.2MSPE提取25-(OH)D2和25-(OH)D3性能評價結果

2.2.1線性、定量限和檢測限 25-(OH)D2和25-(OH)D3分別在1.0～36.0 ng/mL，2.5～90.0 ng/mL范圍內相關性良好，r在各批次均>0.99。25-(OH)D2和25-(OH)D3檢測限分別為0.15 ng/mL、0.15 ng/mL；定量限分別為0.4 ng/mL、0.9 ng/mL，對應變異系數分別為11.71%、7.96%。

2.2.2精密度 25-(OH)D2和25-(OH)D3批內重復精密度分別在5.3%～6.5%、5.1%～6.8%；實驗室內總不精密度分別在7.3%～10.6%、6.1%～8.0%，見表1。

表1 MSPE提取LC-MS/MS測定25-(OH)D的結果

2.2.3絕對回收率 25-(OH)D2絕對回收率在27.7%～31.3%，25-(OH)D3絕對回收率在21.7%～34.3%。

2.2.4相對回收率和準確度 25-(OH)D2和25-(OH)D3相對回收率分別在97.0%～104.0%、96.5%～106.3%，百分偏差均在±15%以內，見表2。

表2 MSPE提取LC-MS/MS測定25-(OH)D的結果

2.2.5基質效應 25-(OH)D2和25-(OH)D3在大氣壓化學電離檢測下幾乎沒有基質效應的抑制，甚至還有些基質增強的趨勢，另外經過同位素內標校正后，相對基質效應均在100%左右，亦可抵消潛在的基質效應，見表3。

表3 MSPE提取LC-MS/MS檢測25-(OH)D的基質效應(%)

2.2.6方法比對 LLE、SLE和MSPE這3種方法提取臨床120例血清標本中25-(OH)D2和25-(OH)D3的結果比較，其中SLE和MSPE相關性均良好(r>0.99)，2種方法比較25-(OH)D相對百分偏差在±15%以內，LLE和MSPE相對來說結果偏差較大(r>0.98)，2種方法比較25-(OH)D相對百分偏差在±25%以內。見圖1～4。

圖1 MSPE和SLE結果的相關性

圖2 MSPE和SLE的Bland&Altaman分析

圖3 MSPE和LLE結果的相關性

圖4 MSPE和LLE的Bland&Altaman分析

3 討 論

目前免疫法和色譜法是檢測血清中25-(OH)D常用的方法，免疫法中有放射免疫法、酶聯免疫吸附試驗、化學發光免疫測定法及電化學發光免疫測定法[13]，色譜法中包括高效液相色譜法和LC-MS/MS[9-12]。其中，免疫類方法的優點是初始投入成本低、高自動化、重現性好，然而特異度和靈敏度不高，不能準確測定25-(OH)D2水平，測試標本后期成本較高，回收率較差等是其不可避免的缺點；高效液相色譜法優點是分離效果好、速度快等，缺點是靈敏度不高、且不能很好的定性等；LC-MS/MS具有靈敏度高、特異度強、準確度高的特點，能同時監測25-(OH)D2和25-(OH)D3，缺點是對檢測人員技術要求高，儀器成本高[14-15]。LC-MS/MS技術檢測25-(OH)D已受到臨床醫生及檢驗人員的共同認可，然而復雜的前處理過程限制了LC-MS/MS在臨床的廣泛應用，MSPE技術的出現為LC-MS/MS技術的自動化進程帶來了革命性的突破。

目前，LC-MS/MS方法進行檢測前均需要進行標本前處理。目前常用的前處理方法主要有固相萃取、液液萃取(包括SLE)、蛋白沉淀及免疫捕獲等。對于水平較低的25-(OH)D及激素類物質往往需要使用較為繁瑣的前處理方法，對實驗室儀器配置和操作人員要求較高，并且不利于實現完全自動化。

本研究中MSPE通過在磁珠表面進行化學基團修飾，待測物與磁珠表面鍵合相發生吸附解吸附，模擬固相萃取的過程，其不同于免疫試劑中抗體包被MSPE的原理。首先活化平衡磁珠，然后加入待測標本，經過充分混合后，待測物與磁珠互相吸附，之后通過不同極性強度的洗脫溶液對磁珠淋洗洗脫，以達到分離和純化的目的。MSPE有別于傳統固相萃取，通過磁珠的轉移來實現目標待測物的分離，不僅過程簡單，自動化程度高，MSPE和LC-MS/MS聯合使用有望成為一種前處理和檢測分析一體的全自動檢測方法。

綜上所述，本研究驗證了MSPE提取25-(OH)D的性能，MSPE和SLE這兩種提取方法具有良好相關性，所得結果基本一致。MSPE有望在未來規模化應用于LC-MS/MS的自動化前處理過程，減少手工操作的誤差，助力于臨床應用。