生物炭施用對節水灌溉稻田甲烷產生菌與氧化菌的影響

彭燈云，楊士紅，李偉征，李 明，戴惠東，周姣艷

（1.河海大學農業科學與工程學院，南京 211100；2.昆山市城市水系調度與信息管理處，江蘇昆山 215300）

0 前 言

稻田是甲烷排放的重要來源[1]，約占農業生產活動的15%左右[2]，作為主要溫室氣體之一，其排放對環境氣候的影響大，稻田的甲烷減排成為了相關領域研究熱點。近年來大量研究表明節水灌溉與生物炭施用均能降低稻田甲烷排放。汪勇等研究表明了生物炭的施用能夠降低南方雙季稻稻田甲烷的排放量，氮肥配施20 t/hm2生物炭和氮肥配施40 t/hm2生物炭能使甲烷累積排放量分別下降32.43%和41%[3]。有研究發現，不同種類的生物炭也能夠不同程度降低甲烷的排放[4]。劉珂純等研究發現生物炭在大田中施用降低了20%左右的甲烷排放，且其甲烷排放量隨著生物炭施用量的增加先增大后減小[5]。也有研究表明水分管理對于稻田甲烷的排放具有重要作用[6-9]。王永明等發現間歇灌溉和控制灌溉這兩種灌溉方式均能顯著減少稻田甲烷的排放，間歇灌溉能顯著降低62.5%～88.0%的甲烷排放總量，控制灌溉的甲烷排放總量降低了68.1%～95.2%[10]。已有研究更多關注減排規律、減排量等，較少關注兩種措施對甲烷產生、排放相關微生物的影響。因此，本文開展節水灌溉與生物炭施加的田間試驗，基于熒光定量PCR 方法研究兩者聯合應用對稻田產甲烷菌和甲烷氧化菌豐度的影響，以期能為稻田甲烷的減排提供科技支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗區條件

試驗地位于河海大學水文水資源與水利工程科學國家重點實驗室昆山試驗研究基地，試區屬亞熱帶南部季風氣候區，年平均氣溫15.5 ℃，年降雨量1 097.1 mm，年蒸發1 365.9 mm，日照時數2 085.9 h，平均無霜期234 d。當地習慣稻麥輪作，土壤為潴育型黃泥土，耕層土壤質地為重壤土，0～18 cm土層土壤有機質21.71 g/kg，全氮1.79 g/kg，全磷1.4 g/kg，全鉀20.86 g/kg，pH值7.4，0～30 cm土壤容重1.32 g/cm3。

1.2 試驗設計

試驗中灌溉模式采用無水層控制灌溉(C)和常規灌溉(F)2種方式。控制灌溉下水稻秸稈生物炭施用量設置3個水平，分別為對照0(A)、中等生物炭施用量20 t/hm2(B)和高生物炭施用量40 t/hm2(C)，常規灌溉下設置高生物炭施用量水平40 t/hm2(FC)，試驗共4 個處理(CA、CB、CC 與FC)，每個處理設3 次重復。水稻秸稈生物炭于2016年水稻移栽前一次性施入，其基本性狀見表1。試驗在蒸滲儀中進行，為小區域尺度的稻田，每個蒸滲儀面5 m2( 2.5 m×2 m)。淹水灌溉在整個生育期均保留3～5 cm 的水層。控制灌溉處理在返青期田面保留10～30 mm薄水層，以后的各個生育期灌溉后稻田不建立水層，以根層土壤水分占飽和含水率60%～80%的組合為灌水控制指標。試驗水稻品種為南粳46，株距13 cm，行距25 cm，每穴苗量為3～4 株。2018年6月23日插秧，10月25日收割。施肥量和施肥時間按照當地農民習慣進行，見表2。

表1 所用生物炭的基本性質Tab.1 the basic properties of the biochar used

表2 施肥時間及施用量Tab.2 the fertilizer time and usage

1.3 樣品采集與分析

供試土樣于水稻分蘗期、抽穗開花及乳熟期分別采集一次。取0～20 cm 表層土壤，用五點法混勻，裝入自封袋中，立即帶回實驗室放在-80 ℃冰箱保存，用于DNA的提取。

1.4 DNA的提取和標準曲線的制作

土壤DNA 用土壤DNA 快速提取試劑盒（MP Biomedicals，美國）提取，每個處理取0.5 g 土壤，操作步驟按照試劑盒操作說明進行。以提取的DNA 為模板，合成特異性引物，對其進行切膠純化，用pMD?19-T Vector Cloning Kit（大連TaKaRa公司）試劑盒克隆，取100μl 菌液均勻涂在含Ampicillin 的瓊脂培養基上過夜培養。隨機取陽性菌株，接種到含氨芐抗性的LB 培養基中過夜培養，然后提取質粒DNA 并用1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的提取質量，并用NanoDrop 分光光度計（NanoDrop Technologies，美國）測定DNA 濃度及純度，并根據目的片段和質粒片段大小計算DNA 中的目的基因拷貝數，通過原始質粒DNA 中目的基因的拷貝數，以10倍梯度稀釋8個梯度濃度。以基因濃度的對數為橫坐標，定量PCR測出的閾值循環次數Ct值為縱坐標繪制標準曲線，見圖1，根據標準曲線計算出DNA 樣品中的pmoA和mcrA基因拷貝數。

圖1 pmoA和mcrA基因標準曲線Fig.1 pmoA and mcrA gene standard curve

1.5 實時熒光定量PCR

本試驗選取產甲烷菌的mcrA基因、甲烷氧化菌的pmoA基因進行實時熒光定量PCR 分析，反應在熒光定量PCR 儀（杭州BIOER，Lightcycle K）上進行。通過實時熒光定量PCR，采用SYBR染料法，根據獲得的標準曲線和定量PCR測出的閾值循環次數Ct值，對樣品進行絕對定量。反應體系總體積為20μL，其中包含10μl SYBR Premix Ex TaqⅡ（Bμlk，寶生物工程（大連）有限公司），正向引物（10μmol/L）、反向引物（10 μmol/L）各0.8 μL，1 μL 的模板DNA，ddH2O 補足至20μL。每個樣本3 個重復。根據基因序列，設計合成引物的信息見表3。擴增條件：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性10 s，60 ℃退火12 s，72 ℃延伸30 s，循環40 次，最后72 ℃單點檢測信號。

表3 引物信息Tab.3 The primer information

1.6 數據統計與分析

采用Excel 2016 進行初步分析，結果用3 次重復的平均值±標準誤表示，并對所得到的數據進行柱狀圖的繪制；用SPSS 19.0統計分析軟件的單因素分析和獨立樣本t檢驗來判斷顯著性水平（p=0.05）。

2 結果與分析

2.1 生物炭施用對節水灌溉稻田甲烷氧化菌和產甲烷菌的影響

各個生育期生物炭施用水平對pmoA和mcrA基因的影響見圖2，本文選取基因拷貝數對數來表征基因豐度。總體來看，除乳熟期CA處理pmoA基因數量低于mcrA基因數量外，3個生育期各處理的pmoA基因豐度均高于mcrA基因豐度，并且在水稻分蘗盛期兩種基因的豐度最大。隨著生育期的延長，各處理的兩種基因的豐度分別呈遞減趨勢。與不施加生物炭相比，施加不同水平的生物炭均增加了稻田土壤pmoA基因和mcrA基因的拷貝數對數。

圖2 不同生育期各處理土壤中pmoA和mcrA基因豐度Fig.2 The abundance of pmoA and mcrA genes in soils of different growth stages and treatments

在乳熟期，高水平(40 t/hm2)和中等水平（20 t/hm2）生物炭的添加均顯著提高了pmoA基因和mcrA基因的豐度。相較于無生物炭添加，CB 和CC 處理的pmoA基因豐度分別顯著增加了26.7%和36.6%（p＜0.05），mcrA基因豐度分別顯著增加了3.6%和8.6%（p＜0.05）。在分蘗期拔節孕穗期，施加中等水平生物炭均可以顯著增加pmoA和mcrA的基因拷貝數對數（p＜0.05），高等水平生物炭的添加也能增加兩種基因的數量，但效果并不顯著。

2.2 灌溉模式對稻田土壤甲烷氧化菌與產甲烷菌的影響

由圖3可以看出，水分管理在一定程度上顯著影響了稻田土壤中甲烷氧化菌和產甲烷菌的基因豐度，見圖3。在3 個生育期中，甲烷氧化菌pmoA基因數量均大于產甲烷菌mcrA基因數量。淹灌處理中，pmoA基因和mcrA基因均在拔節期達到峰值，而控灌處理的pmoA基因和mcrA基因豐度則在分蘗期達到最大。除拔節孕穗期控灌稻田土壤中pmoA和mcrA基因拷貝數對數小于淹灌稻田外，在分蘗期和乳熟期，控制灌溉稻田土壤的pmoA基因和mcrA基因豐度均大于淹水灌溉稻田土壤。

圖3 不同生育期灌溉模式對土壤中pmoA和mcrA基因豐度的影響Fig.3 The effects of irrigation patterns at different growth stages on the abundance of pmoA and mcrA genes in soil

在分蘗期和乳熟期，與FC 處理相比，CC 處理的pmoA基因豐度顯著增加了25.2%和70.5%（p＜0.05），mcrA基因豐度分別顯著增加了12.7%和42.2%（p＜0.05）。在拔節孕穗期，CC處理兩種基因拷貝數對數略低于FC處理，淹水灌溉處理稻田土壤中pmoA基因和mcrA基因拷貝數對數均值分別為4.54 g/μL 和3.95 g/μL，控制灌溉稻田土壤中兩種基因拷貝數對數均值分別為4.21 g/μL和3.67 g/μL。

2.3 稻田土壤pmoA/mcrA比

總體來看，隨著生育期的推移，pmoA/mcrA比有不斷增加趨勢，但各個生育期內pmoA/mcrA比值變化規律不一致，見圖4。控制灌溉條件下，與CA 處理相比，生物炭的施加使分蘗期pmoA與mcrA的比值顯著降低了7.9%左右（p＜0.05）。相反，乳熟期施加生物炭則使pmoA/mcrA比顯著升高了23.3%和26.3%（p＜0.05），而隨著生物炭施用量的增加，比值沒有發生顯著變化。同時，生物炭的施加在拔節孕穗期也并沒有使比值發生顯著變化。在生物炭施加水平一定的情況下，與淹水灌溉處理相比，控制灌溉處理在拔節期的pmoA與mcrA比值略微降低，但效果不顯著。在分蘗期和乳熟期控制灌溉處理則顯著增加了pmoA/mcrA比值（p＜0.05）。

圖4 不同生育期各處理間pmoA和mcrA基因拷貝數對數的比值Fig.4 The ratio of pmoA and mcrA gene copy number logarithms between treatments at different growth stages

3 討 論

3.1 生物炭對稻田土壤甲烷氧化菌和產甲烷菌豐度的影響

本實驗發現在分蘗期兩種基因豐度達到峰值，且隨時間逐漸減小，推測可能由于分蘗期水稻生長旺盛，甲烷氧化菌和產甲烷菌活性較強[13]，導致兩種基因豐度隨之增強。李大明等發現在一定條件下產甲烷菌和甲烷排放存在一定正相關關系[14]，且也已有研究表明在水稻分蘗期甲烷排放驟然增多而后消減[15,16]，這與本研究的發現一致。通過測定稻田土壤中的pmoA基因和mcrA基因，發現生物炭的施加能顯著提高甲烷氧化菌和產甲烷菌基因豐度（p＜0.05），這些與許欣等的研究結果基本一致[17]。甲烷氧化菌基因豐度的提高可能是因為生物炭發達的孔隙結構能夠更好的增加土壤的氧氣含量[18,19]，土壤的通氣性大大改善，為甲烷氧化菌提供了良好的生長環境[20]。

控制灌溉條件下，生物炭的添加也顯著增加了產甲烷菌基因豐度，但小于生物炭對甲烷氧化菌基因的促進程度。這可能是由于生物炭提高了土壤中微生物生物量碳的濃度[21]，通過消耗可利用的土壤碳源，產甲烷菌的更迭演替速度加快，所以mcrA基因拷貝數對數能夠顯著增加。這說明了生物炭的加入相當于為土壤中加入了營養物質，微生物可利用底物增加[22]，各種生物量都有可能增加。但各處理在不同生育期甲烷氧化菌pmoA基因拷貝數對數高于產甲烷菌mcrA基因（圖2），這與劉少文等研究的水稻移栽后不同天數pmoA基因拷貝數總小于mcrA基因拷貝數的結果不一致[23]，也有研究表明mcrA基因豐度與甲烷通量的動態關系更為密切[24]，與pmoA基因拷貝數負相關，說明甲烷排放量并不完全局限于產甲烷菌或甲烷氧化菌基因其中的任何一個[25]，可能與pmoA/mcrA比的變化關系密切[26]。

3.2 灌溉方式對稻田土壤甲烷氧化菌和產甲烷菌豐度的影響

如圖3所示，在施加高水平生物炭的條件下，除拔節期外，控制灌溉顯著提高了pmoA基因和mcrA基因豐度。控制灌溉導致甲烷氧化菌pmoA基因拷貝數對數的增加與前人研究一致[27]。有大量研究表明控制灌溉改變了常規灌溉稻田的厭氧環境，增加了土壤中氧氣濃度[28,29]，可利用的底物增多促進了好氧菌的生長[30]，這可能是pmoA基因豐度增高的主要原因。

控制灌溉水分虧缺促進了水稻根系的生長[31]，研究表明，水稻根長、白根數量等均高于淹水灌溉稻田[32,33]，控制灌溉水稻自身調節產生大量的根系分泌物[34,35]，為產甲烷菌的生長提供了豐富有機質的類型和總量，導致節水灌溉稻田土壤產甲烷菌mcrA基因豐度有所增高。本研究結果也發現控灌處理pmoA基因和mcrA基因的峰值出現在分蘗期，而淹灌處理的峰值出現在拔節期，這與前人關于節水灌溉和常規灌溉對甲烷排放峰值的結果一致[36]，進一步說明了甲烷氧化菌及產甲烷菌基因豐度與甲烷排放有著密切聯系。

3.3 生物炭施用及灌溉方式對稻田土壤pmoA 與mcrA比值的影響

施加生物炭和控制灌溉都促進了pmoA基因和mcrA基因豐度，但對mcrA基因的促進作用小于pmoA基因，因此可以用pmoA/mcrA比值來說明生物炭及灌溉方式對兩種菌豐度的影響。已有研究表明，pmoA/mcrA比值可以很好的解釋田間甲烷排放量的問題[37]。吳訥等研究發現，土壤甲烷的排放與pmoA基因或者mcrA基因其中任何一個有相關關系，而與二者的比值顯著相關[8]。吳震等[38]、李松等[39]研究發現生物炭施用能夠抑制稻田甲烷的排放。王均美等通過研究稻田產甲烷菌數量和甲烷產生率發現相較于淹水灌溉，控制灌溉可以減少土壤甲烷的排放[40]。岳進等也發現稻田土壤甲烷的排放受到甲烷氧化菌和產甲烷菌共同代謝的影響，并且節水灌溉可以減少土壤中甲烷的排放[41]。本研究發現，施加生物炭和控制灌溉在乳熟期均能夠顯著提高pmoA/mcrA比，表明甲烷氧化能力強于產甲烷能力，進一步說明生物炭施用和控制灌溉能夠減少土壤甲烷排放。

4 結 論

本文通過研究了控灌條件下不同水平的生物炭施用對節水灌溉稻田甲烷氧化菌和產甲烷菌基因豐度的影響，主要結果與結論如下：

（1）生物炭施用能夠提高節水灌溉稻田土壤pmoA基因和mcrA基因豐度，乳熟期高等水平生物炭添加效果更顯著，而中等水平生物炭在分蘗期和拔節孕穗期效果更顯著。乳熟期相較于無生物炭添加，CB 和CC 處理的pmoA基因豐度分別增加了26.7%和36.6%，mcrA基因豐度分別增加了3.6%和8.6%。分蘗期CB 處理相較于CA 處理來說，pmoA基因和mcrA基因豐度分別增加了7.8%和17.2%；拔節孕穗期CB 處理相較于CA處理來說，pmoA基因和mcrA基因豐度分別增加了6.7%和6.9%。

（2）控制灌溉在分蘗期和乳熟期能夠顯著增加稻田土壤pmoA和mcrA基因豐度。在分蘗期和乳熟期，與FC 處理相比，CC 處理的pmoA基因豐度顯著增加了25.2%和70.5%，mcrA基因豐度分別顯著增加了12.7%和42.2%。

（3）控制灌溉和施加生物炭均能顯著增加pmoA/mcrA比值，即控制灌溉和生物炭施加能夠提高土壤的甲烷氧化能力，減少稻田土壤甲烷的排放。乳熟期施加生物炭使pmoA/mcrA顯著升高了23.3%和26.3%；在分蘗期和乳熟期控制灌溉處理pmoA/mcrA比值分別顯著增加了11.1%和20%。