FCGBP 在頭頸鱗狀細胞癌中的表達和免疫功能分析

曹宇杰，沈志森，葉棟，陳佳意

有研究發現IgG-Fc 片段結合蛋白（FCGBP）在多種腫瘤發生、進展中起著重要作用，且與多種腫瘤的免疫細胞浸潤相關。在結直腸癌中，特別是在轉移性組織中，FCGBP 被發現高表達，并且FCGBP 的表達增加顯著降低了結直腸癌患者的整體生存率[1]。而在膽囊癌中，FCGBP的表達相較于正常組織降低，并且是腫瘤生長因子1（TGF-1）誘導的上皮間充質轉換的關鍵調節因子[2]。還有研究發現FCGBP在前列腺癌中低表達，且與疾病進展有關[3]。然而FCGBP 在頭頸鱗狀細胞癌（HNSC）中的作用和機制尚不清楚，本研究評估了FCGBP 在HNSC中的表達情況及其與預后的相關性，并初步探究FCGBP 與HNSC 免疫細胞浸潤的關系?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 從癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫（https:/cancergenome.nih.gov//）下載基因轉錄組測序數據共544 例，其中499 例HNSC腫瘤組織數據，45 例正常組織數據。對每例腫瘤樣本下載對應相關臨床數據進行分析，包括年齡、性別、腫瘤分級、T 分期、N 分期和臨床分期。人HNSC 標本15 例（在距腫瘤病灶邊緣＞0.5 cm 處解剖）均來自在寧波大學附屬李惠利醫院住院并接受手術的患者，由病理醫師盲檢后確認為腫瘤或癌旁正常組織，并獲得本院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 FCGBP表達水平、臨床預后和通路富集分析 采用R 軟件（3.5.1 版本）分析FCGBP 在499 例HNSC 腫瘤組織和45 例正常組織中的表達水平差異并作圖，使用R 軟件“survival”包進行Cox風險回歸分析和生存曲線分析。使用“clusterProfiler”包的gseKEGG 函數進行基因集富集分析（GSEA）。

1.2.2 免疫組織化學染色與分析 采用甲醛固定手術切除的HNSC腫瘤及鄰近組織，石蠟包埋后切成4 m 厚的切片，再用二甲苯和乙醇脫蠟。將切片在檸檬酸鈉緩沖液（pH值6.0）中120℃煮沸20min，進行抗原修復，然后在3% H2O2中室溫孵育10 min 以阻斷內源性過氧化物酶。再將切片與FCGBP 兔單克隆抗體[Ab cam（Ab121202），Cambridge，UK]進行免疫反應，然后與二抗一同孵育。切片用二氨基聯苯胺（Sigma，Cat No.ZLI-9018）溶液顯色，蘇木精復染，用各種濃度的酒精脫水后封片。在顯微鏡下觀察FCGBP 免疫反應切片并由病理學醫師解釋。

1.2.3 免疫細胞浸潤分析 采用由Newman 等[4]開發的CIBERSORT 軟件計算基于基因表達數據的特定組織中的細胞組成，并評估目標細胞豐度。本研究利用R 軟件對下載的HNSC 腫瘤組織數據進行篩選和矯正，然后使用CIBERSORT軟件評估22 種免疫細胞浸潤水平。利用R 軟件統計FCGBP 表達量和免疫細胞浸潤水平的相關性并繪圖。

1.3 統計方法 采用R 軟件及CIBERSORT 軟件進行數據分析，計數資料采用2檢驗和Fisher 精確檢驗，并采用單因素及多因素Cox 回歸分析。P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FCGBP 在HNSC 中的表達分析FCGBP 在HNSC 腫瘤組織中低表達（封四彩圖1），FCGBP 低表達水平的HNSC患者OS 較差（P ＜0.001），預后不佳（封四彩圖2）。進一步選擇了3 種類型的HNSC腫瘤組織（舌癌5 例、喉癌5 例、下咽癌5例）和配對癌旁組織進行免疫組化實驗，結果顯示FCGBP在HNSC腫瘤組織中染色強度顯著降低（封四彩圖3）。

圖1 正常組織和HNSC 腫瘤組織的FCGBP 表達水平

圖2 不同FCGBP 表達水平的HNSC 生存率

圖3 舌癌、喉癌、下咽癌腫瘤組織和癌旁正常組織的免疫組化染色結果（envision 二步法，×20）

圖4 不同FCGBP 表達水平的HNSC 患者年齡、性別、病理分級、T 分期、N 分期、臨床分期的分布情況

2.2 FCGBP 表達水平及其與HNSC 患者臨床病理因素的相關性 FCGBP 的表達水平與HNSC 患者的T 分期及臨床分期有關（封四彩圖4）。相較于FCGBP 高水平表達組，在FCGBP 低水平表達組中，更高級別T 分期的HNSC患者比例明顯增加（P=0.02），更高級別臨床分期的HNSC患者比例也明顯增加（P=0.009）（圖1）。單因素Cox 回歸分析顯示，FCGBP 表達量、年齡及臨床分期是影響預后的危險因素，見表1。多因素Cox 回歸分析顯示，FCGBP 表達量、年齡及臨床分期是影響HNSC 患者預后的獨立危險因素，見表2。

圖1 FCGBP 表達水平與HNSC 患者T 分期和臨床分期相關

表1 影響HNSC 患者生存的預后因素的單因素Cox 回歸分析

表2 影響HNSC 患者生存的預后因素的多因素Cox 回歸分析

2.3 FCGBP 在HNSC 中的GSEA 分析

在前10 條富集通路中發現有多條通路可能與免疫細胞相關，如細胞黏附分子、T細胞受體信號通路、B細胞受體信號通路、細胞因子及細胞因子受體相互作用通路。

2.4 FCGBP 與HNSC 中免疫細胞浸潤相關性 與FCGBP 低表達組相比，在FCGBP 高表達組中，幼稚B 細胞、漿細胞、濾泡輔助性T 細胞（Tfh）、調節性T細胞（Tregs）、靜息樹突狀細胞及靜息肥大細胞浸潤水平較高，而CD8+T 細胞、靜息NK 細胞、M0 巨噬細胞、M2 巨噬細胞、嗜酸性粒細胞及中性粒細胞浸潤水平較低。見圖2。

圖2 FCGBP 與HNSC 中免疫細胞浸潤相關性

3 討論

相較于正常組織，FCGBP 在HNSC腫瘤組織中低表達，并利用免疫組化實驗證實了這一發現。據報道，在結腸癌中，與非轉移性組織相比，FCGBP 在轉移性組織中表達下調[5]。在骨肉瘤中，FCGBP 也被發現在腫瘤組織中表達下調。Wang 等[6]關于FCGBP 的泛癌研究發現，FCGBP在HNSC等7 種腫瘤組織中低表達，而在乳腺癌等14 種腫瘤中高表達，不同腫瘤類型中FCGBP的表達水平差異可能反映了不同的作用機制。本研究進一步發現 FCGBP 低表達與HNSC 患者的不良預后有關。臨床病理因素分析表明，FCGBP 表達水平、年齡和臨床分期與HNSC 患者預后相關，并且是獨立的預后影響因子。這些結果提示FCGBP具有生物標志物的潛力，并可能作為HNSC 的保護因子。還有研究發現在HPV 感染的HNSC 患者中FCGBP表達水平上調，推測FCGBP 還與HPV感染有關，并且其上調與患者較長的生存時間相關[7]。GSEA 的KEGG 通路分析結果顯示FCGBP 參與了多種免疫相關信號通路，這提示FCGBP可能在調節腫瘤免疫中起關鍵作用。

B細胞（也稱B淋巴細胞）可生成抗體，充當抗原呈遞細胞，并分泌細胞因子。Naive B 細胞可發育成為其他成熟B 細胞。漿細胞是終末分化的B 淋巴細胞，可構成性地分泌抗體，提供針對病原體的保護[8-9]。漿細胞可生成IgM、IgG 和IgE等高親和力的抗體，提供免疫記憶[10]。Tfh 可以促進生發中心（GC）內B 細胞分化成漿細胞和記憶性B 細胞[11-13]。樹突狀細胞可以誘導T 細胞活化和分化，從而啟動適應性反應，并且可以增強并調節免疫反應，增強外周T 細胞的耐受性[14-15]。肥大細胞經IgE 介導后活化，可能在抗腫瘤免疫中起重要作用[16]。本研究進一步評估了HNSC 腫瘤組織中22種免疫細胞的浸潤水平，發現上述有利于免疫抑制作用的免疫細胞在高FCGBP表達組中浸潤水平增加。M2 巨噬細胞主要參與降低炎癥反應，與免疫抑制有關。一項前列腺癌的研究顯示，相較于M2 巨噬細胞低表達組，高表達組患者生存率明顯降低，且M2 巨噬細胞被認為是獨立的危險因素[17]。M0 巨噬細胞又稱非活性巨噬細胞，可以被細胞因子誘導從而向M1 或M2 表型轉化。有研究發現M0 巨噬細胞浸潤比例高的膀胱癌患者預后差[18]。在本研究中，M2、M0 巨噬細胞浸潤水平在高FCGBP 表達組中顯著降低，這提示FCGBP 可能降低了M0 巨噬細胞的表達水平，抑制M2 型巨噬細胞的轉化。