PD-L1、CTLA-4 及CD276 蛋白在肝癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系

厲張金，王婕，樂婷，馬海潔

我國肝癌的發病率和病死率較高，5 年生存率＜5%，其中高轉移率是患者預后不良的最重要原因之一[1]。B7 家族是最重要的共刺激分子，其中B7 同源物1（B7H1）可與活化T細胞表面表達的程序性死亡因子-1（PD-1）結合，抑制T 細胞受體（T-TCR）介導的T 細胞活化，在腫瘤細胞免疫逃逸中發揮極其重要的作用[2]。細胞程序性死亡配體1（PD-L1）和CD276 分別是B7H1 和B7H3 家族中最重要的兩個成員之一。細胞毒T 淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4）可與B7 分子結合，參與免疫反應的負調節，為重要的免疫卡控點。本研究擬探討PD-L1、CTLA-4及CD276 蛋白在肝癌組織中的表達及其與患者臨床病理特征的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 84 例肝癌組織樣本購自上海芯超生物科技有限公司，組織芯片編號為HLivH090Su01。納入標準：（1）接受原發性肝癌切除手術患者；（2）病理診斷為肝癌，具有完整的臨床病理資料；（3）肉眼辨認腫瘤病灶直徑＞1 cm；（4）患者術前未接受過放化療、分子靶向治療及免疫治療。其中男75 例，女9 例；年齡31～78 歲，平均（52.3±10.7）歲；按照國際抗癌聯盟的AJCC分期（第七版）為Ⅰ期55 例，Ⅱ～Ⅲ期29 例；腫瘤直徑＞5 cm 26 例，≤5 cm 58 例；所有組織均經過10%甲醛固定、石蠟包埋。

1.2 觀察指標（1）患者基本資料：年齡及性別；（2）肝癌組織病理資料：病理分級、腫瘤大小、腫瘤數目、腫瘤包膜是否完整及T/AJCC 臨床分期等指標；（3）患者病理資料：肝硬化、血液中乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒核心抗體（HBcAb）、丙型肝炎病毒（HCV）抗體、總膽紅素（TB）、丙氨酸氨基轉氨酶（ALT）及甲胎蛋白（AFP）含量等指標；（4）免疫組織化學檢測PD-L1、CTLA-4、CD276、CD4 及CD8 蛋白的表達情況。

1.3 免疫組織化學法檢測 肝癌石蠟包埋組織塊制成后，連續切片約4 m厚度，HE 染色，經脫蠟、抗原修復后，采用二步法染色檢測 PD-L1、CTLA-4、CD276、CD4 及CD8 蛋白表達。一抗均來自河南賽諾特生物公司（貨號分別是C12A19、G219-1129、GM024 和EP51），陰性對照則用PBS 磷酸緩沖液替代一抗。所用二抗是DAKO EnVisionTM 二步法抗兔、鼠通用型免疫組化試劑。將顯色后的片子用清水沖洗一段時間后，浸泡于蘇木素中染色30 s完成細胞核復染。最后脫水后，完成封片。

1.4 結果判定 染色強度：無著色為0分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分，深褐色為4 分。陽性范圍：隨機觀察5 個中倍視野（10×20），每個視野計數100 個腫瘤細胞，將各個視野中陽性細胞數的平均百分比作為該切片的陽性細胞百分比；0 為0 分，＜1%為1 分，1%～10%為2 分，11%～33%為3 分，34%～66%為4 分，＞66%為5 分。上述兩項結果相乘，0～5 分定義為該基因低表達，6～12 分定義為該基因高表達。判定過程由2 名以上具有認證資質的病理科醫生通過雙盲法獨立進行，有異議的病例則提交上級醫師進行重新判讀。

1.5 統計方法 數據利用SPSS 15.0 軟件及GraphPad Prism 5.0 軟件分析，所有數據均用方差同質性檢驗。計數資料采用2檢驗或Fisher 精確檢驗。P ＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PD-L1及CTLA-4表達與肝癌臨床病理特征的關系 84 例標本中，PD-L1高表達33 例，低表達51 例；CTLA-4 高表達15 例，CTLA-4 低表達69 例。PDL1 高表達組肝硬化陽性例數、ALT≤40 U/L 例數占比均高于PD-L1 低表達組（均P ＜0.05）。PD-L1 表達水平與其余臨床病理特征差異均無統計學意義（均P ＞0.05）。CTLA-4 表達水平在不同的臨床病理特征中的差異均無統計學意義（均P ＞0.05），見表1。

表1 肝癌臨床病理特征與PD-L1、CTLA-4 分子表達的關系 例（%）

2.2 CD276 表達與肝細胞癌臨床病理特征的關系 84 例標本中，CD276 高表達40 例，CD276 低表達44 例。兩組AFP＜100 g/L例數占比差異有統計學意義（P ＜0.05），其他肝癌臨床病理特征差異均無統計學意義（P ＞0.05），見表2。

表2 肝癌臨床病理特征與CD276 分子表達的關系 例（%）

3 討論

近年來，癌癥免疫治療成為研究熱點，特別是免疫卡控點抑制劑（ICIs）已經證明在肝癌中具有顯著的抗腫瘤活性和可控制的耐受性。針對PD-1、PD-L1 和CTLA-4 的抗體可以阻斷免疫卡控點[3]，通過恢復耗竭T 細胞以增強腫瘤免疫力。目前，聯合使用ICIs、分子靶向藥物，全身治療或局部治療的聯合治療策略已在多種類型癌癥的臨床前和臨床研究中充分證實有效，但大多數肝癌患者并未從中受益。本研究將 PD-L1、CTLA-4 和CD276 聯合作為研究對象，研究其在肝癌組織中的表達水平，以期為肝癌免疫聯合治療方案提供依據。

研究表明，T細胞活化與增殖依賴于雙信號：一是抗原遞呈細胞（APC）遞呈的抗原肽-人類白細胞抗原（HLA）復合物，由特殊T 細胞抗原受體（TCR 識別），并將信號傳遞給T 細胞，這是T 細胞活化必需的，但不引起T 細胞增殖和分泌細胞因子；二是共刺激信號（co-stimulatingsignal，第二信號），共刺激信號是T 細胞抗原特異性激活必需的，啟動、維持并調節活化級聯反應，決定了T 細胞是活化增殖，或轉變為無反應狀態甚至凋亡。

B7 家族是最重要的共刺激分子，是一類屬于IgSF 具有高度同源性的基因，為跨膜蛋白，基本成員有B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2 和B7-H3 等。B7 家族成員表達后形成單鏈糖蛋白，大都存在于細胞壁上，分布于人體絕大部位的抗原遞呈細胞，在腫瘤免疫中作為第二信號，起著至關重要的作用。B7H1 與活化T 細胞表面表達的PD-1 結合后，抑制T-TCR 介導的T細胞活化[4]，導致活化T細胞的凋亡，在協助腫瘤細胞逃避免疫系統殺傷中起著極其重要作用[5]。B7H3 是316 個氨基酸組成的I 型跨膜糖蛋白，最初是通過對人樹突狀細胞來源的cDNA 庫進行核酸序列分析得到的B7 家族同源基因，屬于免疫球蛋白超家族。PD-L1 和CD276 分別是B7H1 和B7H3 家族中最重要的兩個成員之一[6]，在不同癌癥中均高表達。

CTLA-4 又名CD152，是一種白細胞分化抗原，是T 細胞上的一種跨膜受體[7]，與CD28 共同享有B7 分子配體，而CTLA-4 與B7 分子結合后誘導T 細胞無反應性，參與免疫反應的負調節。基因重組的CTLA-4 Ig 可在體內外有效、特異地抑制細胞和體液免疫反應，對移植排斥反應及各種自身免疫性疾病有顯著的治療作用，毒副反應極低，是目前被認為較有希望的新的免疫抑制藥物。本研究結果顯示，在肝癌組織中，PD-L1 表達水平與肝硬化陽性率及ALT 表達水平有關，CD276 表達水平與患者血清中AFP 含量有關。這表明PD-L1 及CD276與肝癌發生發展密切相關，為潛在的肝細胞癌免疫治療的實驗室指標。