初烤和復烤對煙葉真菌群落結構的影響

成 瑜，劉 京，高英明，3，周家喜，芶劍渝，管景強，鄒 曉*，

1. 貴州大學生命科學學院真菌資源研究所，貴陽市花溪區甲秀南路515 號 550025

2. 貴州省煙草公司遵義市公司，貴州省遵義市匯川區人民路341 號 563000

3. 貴州大學農業生物工程研究院，貴陽市花溪區甲秀南路515 號 550025

煙草是我國重要的經濟作物，從新鮮煙葉到成品卷煙，采收后的煙草需經過初烤、復烤和儲存陳化等一系列加工過程［1-2］。其中初烤和復烤是決定煙葉品質和產量的關鍵環節，對煙葉真菌群落結構有重要影響［3-4］。初烤過程包括低溫高濕的變黃階段、高溫中濕的定色階段和高溫低濕的干筋階段［5］，復烤過程包括真空回潮、潤葉、打葉和復烤等加工環節［4］。

陳乾麗［3］研究發現初烤和復烤過程中煙葉所處的自然和加工環境會提高霉菌污染的概率，增加煙葉霉變的風險。煙葉霉變可影響煙葉的外觀和品質，降低煙葉的使用價值，造成了巨大的經濟損失［6-7］。Welty 等［8］研究表明曲霉和青霉等真菌是引起煙葉霉變的主要微生物。目前關于霉變煙葉真菌群落組成的研究已有大量報道。趙文姬［9］采用稀釋平板法分離出云南霉變煙葉真菌38株，經鑒定分別屬于曲霉屬、青霉屬、根霉屬、毛霉屬和木霉屬。陳乾麗等［10］通過高通量測序技術研究發現貴州興義地區烤后霉變煙葉中的優勢屬是曲霉屬、青霉屬和鏈格孢屬等。Zhou 等［11］對吉林、貴州和上海3 地霉變陳化煙葉的研究發現，其優勢真菌類群為曲霉屬、耐干霉菌屬和節擔菌屬。然而，目前大多數研究主要集中在引起煙葉霉變真菌的種類和數量，而這些真菌具體于哪個加工階段在煙葉上富集的相關研究還鮮見報道。為此，采用高通量測序技術對貴州湄潭、平壩和惠水3地4個加工階段（初烤前、初烤后、復烤前和復烤后）的煙葉真菌群落進行檢測，旨在進一步探究在煙葉加工過程中霉菌富集的主要階段和變化過程。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019 年7 月至12 月在貴州省遵義市湄潭縣、安順市平壩縣和黔南州惠水縣3地的煙田、烤房和復烤廠采集了初烤前（新鮮煙葉）、初烤后、復烤前和復烤后4個加工階段的煙葉樣品。初烤前煙葉：在煙葉成熟期，采用五點取樣法，從田間（20 m×20 m）隨機采收15片煙葉［12］。初烤后煙葉：從烤房的上層、中層和下層隨機各選擇5片煙葉并混合。復烤前煙葉：在煙葉真空回潮前的煙堆中隨機抽取15片煙葉并混合。復烤后煙葉：在復烤結束時隨機收集500 g煙葉。共采集到12 個樣品，樣品均為中部葉，品種為云煙87。將樣品置于無菌袋儲存于-80 ℃冰箱中。

1.2 真菌總DNA提取、PCR擴增及高通量測序

采 用E.Z.N.A.?soil DNA kit 試 劑 盒（美 國Omega 公司）提取煙葉表面和內部微生物總DNA，提取后采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其品質，使用NanoDrop2000 紫外-可見分光光度計（美國Thermo Scientific公司）檢測DNA濃度。使用正向引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和 反向 引物ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）擴增真菌內源轉錄間隔區（ITS1）區域。PCR擴增反應體系（20 μL）：5×TransStart FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mM/L dNTPs 2 μL，上游引物（5 μM/L）0.8 μL，下游引物（5 μM/L）0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 補足至20 μL。擴增程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，從變性到延伸共30 個循環；72 ℃延 伸10 min，4 ℃保 存。PCR 產 物 使 用AxyPrep DNA 凝膠提取試劑盒（美國Axygen Biosciences公司）進行純化，并使用QuantiFluor?-ST微型熒光計（美國Promega公司）進行定量。經處理的PCR擴增產物由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成Illumina MiSeq測序。

1.3 數據處理

1.3.1 序列處理及OTUs注釋

根據Overlap關系將Miseq測序得到PE reads進行拼接，對序列質量進行質控和過濾，根據序列首尾兩端的Barcode和引物序列區分樣品得到有效序列，校正序列方向獲得優化序列。

通過UPARSE 7.0.1090軟件［13］（http：//drive5.com/uparse/）對 序 列 進 行OTUs（Operational Taxonomic Unit，操作分類單元）聚類，聚類相似度水平為97%。選擇OTUs 的代表性序列通過RDP Classifier 2.2 軟件［14］（http：//rdp.cme.msu.edu/）與Unite Release 8.0 數據庫（http：//unite.ut.ee/index.php）進行物種分類注釋。使用Mothur 軟件（https：//www.mothur.org/wiki/Download_mothur）計算各組樣本的α多樣性指數，包括香農（Shannon）指數、辛普森指數（Simpson）、Ace指數、Chao指數、Sobs指數及覆蓋度指數。

1.3.2 真菌群落動態變化分析

根據物種注釋和豐度信息，分析不同加工階段優勢真菌類群，其中相對豐度小于0.01%的物種歸為“其他”。在屬水平上選擇了總豐度排名前35 個類群，利用熱圖分析不同加工階段樣品中優勢真菌類群的變化。利用韋恩圖分析OTUs 在不同加工階段的數量差異。利用LEfSe系統分析不同加工階段樣品間存在顯著差異的物種（LDA=2）。利用FUNGuild 數據庫（http：//www.stbates.org/guilds/app.php）解析不同加工階段煙葉真菌的營養方式（Trophic mode）和對環境資源的吸收利用方式（Guild）。使用SPSS 20.0 軟件對α多樣性指數進行差異性分析。

2 結果與分析

2.1 高通量測序結果

如圖1 所示，隨著樣品序列數的增加，Shannon-Winner 指數曲線越趨向平坦，表明本試驗中測序的數據深度可較全面地反映測序樣品中微生物信息。

圖1 Shannon-Winner指數曲線Fig.1 Shannon-Winner index curves

經優化處理，12 個樣本共檢測到834 184 條有效序列，189 990 454 個堿基，平均每個樣本60 441～74 962條序列，序列長度為140～531 bp。本次檢測中共鑒定出4個門、23個綱、71個目、196個科、445個屬和1 171 個OTUs。由表1 可知，反映物種多樣性的香農指數和辛普森指數值分別在1.80～2.43 和0.25～0.34之間，反映真菌豐富度的Chao指數和ACE指數分別在353.30～423.82和275.58～429.52之間，Sobs指數在298.00～384.67之間。4個加工階段樣品覆蓋度指數均達0.98以上，表明本次測序數據合理。

表1 不同加工階段煙葉真菌α多樣性指數①Tab.1 Alpha diversity index of tobacco leaf fungi of different processing stages

2.2 真菌群落組成

在門水平上，擔子菌門（Basidiomycota）和子囊菌門（Ascomycota）為4個加工階段共有優勢菌門；其次是毛霉門（Mucoromycota）（圖2）。擔子菌門相對豐度下降幅度較大（從初烤前的73.56%降至復烤后的52.1%），而子囊菌門相對豐度上升幅度較大（從初烤前的26.21%上升至復烤后的47.26%）。

圖2 不同加工階段煙葉真菌群落組成（門水平）Fig.2 Tobacco leaf fungal community composition at phylum level of different processing stages

物種相對豐度柱狀圖（圖3）表明，在屬水平上，初烤前優勢屬為 Sampaiozyma、枝孢菌屬（Cladosporium）和Symmetrospora 等。初烤后優勢屬為Sampaiozyma、鏈格孢屬（Alternaria）、未分類的亞隔孢殼科（Didymellaceae）真菌和枝孢菌屬（Cladosporium）等。 復烤前優勢屬為曲霉屬（Aspergillus）、Sampaiozyma 和根霉屬（Rhizopus）等。復烤后優勢屬為Sampaiozyma 和曲霉屬（Aspergillus）等。Sampaiozyma 是4 個加工階段共有優勢屬，在各階段其相對豐度分別為44.27%、37.87%、24.12%和46.12%。曲霉屬（Aspergillus）在初烤前的相對豐度僅為0.05%，在初烤后、復烤前和復烤后相對豐度分別 為2.86% 、60.82% 和25.78% 。 鏈 格 孢 屬（Alternaria）在初烤前的相對豐度為0.5%，初烤后其相對豐度達到18.42%，復烤后降至1.3%。未分類的亞隔孢殼科（Didymellaceae）真菌和枝孢菌屬（Cladosporium）的相對豐度也呈現初烤后上升和復烤后下降的趨勢。而初烤前相對豐度較高的Symmetrospora在后3個加工階段中持續降低。

圖3 不同加工階段煙葉真菌群落組成（屬水平）Fig.3 Tobacco fungal community composition at genus level of different processing stages

層次聚類熱圖（圖4）表明，初烤前和復烤后的群落結構較相似，故先聚為一類，再與初烤后真菌群落聚類，最后與復烤前真菌群落聚類。結果表明初烤后和復烤后的真菌群落差異較小，復烤前的真菌群落與初烤后和復烤后的真菌群落差異較大，這意味著初烤后的真菌群落在復烤前產生了變化，在復烤后又發生了變化。整個群落變化規律為初烤前煙葉中微球黑粉菌綱的Sampaiozyma 和囊擔子菌綱的Symmetrospora 占優勢；初烤后煙葉中微球黑粉菌綱的 Sampaiozyma 和座囊菌綱的枝孢菌屬（Cladosporium）和鏈格孢屬（Alternaria）占優勢；復烤前煙葉中散囊菌綱的曲霉屬（Aspergillus）、微球黑粉菌綱的Sampaiozyma、座囊菌綱的鏈格孢屬（Alternaria）和節擔菌綱的節擔菌屬（Wallemia）占優勢；復烤后微球黑粉菌綱的Sampaiozyma和散囊菌綱的曲霉屬（Aspergillus）占優勢。

圖4 不同加工階段煙葉真菌的聚類熱圖（屬水平）Fig.4 Clustering heatmap of fungi at genus level of different processing stages

2.3 不同加工階段煙葉OTUs數量變化

由圖5 可知，4 個加工階段的真菌種類存在差異。初烤前、初烤后、復烤前和復烤后煙葉的共有OTUs 數量為228 個（占所有OTUs 數量的19.47%）。較初烤前，初烤后、復烤前和復烤后OTUs 數量分別下降了18.45%、22.67%和15.21%。初烤前、初烤后、復烤前和復烤后煙葉的特有OTUs 數量分別為201、102、89 和128 個，分別占所有OTUs 數量的17.16%、8.7%、7.6%和10.93%，其中初烤前特有OTUs數量最多。初烤前煙葉的OTUs 數量和特有OTUs 數量均高于另外3個加工階段。

2.4 LEfSe物種差異分析

不同加工階段LEfSe物種差異分析結果見圖6，LDA值表示每個組分（物種）相對豐度對差異效果影響的大小。結果表明，在能夠檢測到的屬水平上（排除Norank 和Unclassified 的類群）各樣本之間LDA值＞2.0 的真菌類群有6 個，分別是初烤前的Bannoa屬和赭霉屬（Ochroconis），復烤前的曲霉屬（Aspergillus）和 節 擔 菌 屬（Wallemia），復 烤 后 的Cutaneotrichosporon和青霉屬（Penicillium）。

圖6 不同加工階段煙葉LEfSe物種差異分析圖Fig.6 Analysis of tobacco leaf LEfSe species differences at different processing stages

2.5 FUNGuild功能類群預測

利用FUNGuild對煙葉真菌群落進行功能預測，結果顯示4個加工階段共鑒定出1 171個OTUs，被劃分為8個真菌功能類群，即腐生菌群（Saprotroph）、共生菌群（Symbiotroph）、病理菌群（Pathotroph）、腐生-共生過渡型（Saprotroph-Symbiotroph）、病原菌-腐生-共生菌群（Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph）、病理寄生-腐生菌群（Pathotroph-Saprotroph）、病理寄生-共生菌群（Pathotroph-Symbiotroph）和病原-腐生-共生菌群（Pathogen-Saprotroph-Symbiotroph）。其中復烤前后的腐生菌群（Saprotroph）相對豐度均高于初烤前后，復烤前最高。

根據對環境資源的吸收利用方式，4 個加工階段煙葉真菌可分為65 個共位群，其中在初烤前煙葉中動物病原菌-內生菌-植物病原菌-木腐菌（Animal Pathogen-Endophyte-Plant Pathogen-Wood Saprotroph）和動物病原菌-內生菌-地衣寄生菌-植物病原菌-木腐菌（Animal Pathogen-Endophyte-Lichen Parasite-Plant Pathogen-Wood Saprotroph）的相對豐度較高；初烤后和復烤后煙葉中均是植物病原菌-內生菌-植物病原菌-木腐菌（Animal Pathogen-Endophyte-PlantPathogen-WoodSaprotroph）的相對豐度較高；而復烤前煙葉中未定義腐生菌（Undefined Saprotroph）的相對豐度較高（圖7）。

圖7 基于OTUs水平注釋表的真菌功能群相對豐度Fig.7 Relative abundances of fungal functional groups based on OTUs annotation table

3 討論

真菌群落分析表明，擔子菌門和子囊菌門在4個加工階段均為優勢門，這與Welty 等［15］和陳善義等［16］的研究結果一致。然而，本研究中，擔子菌門相對豐度下降幅度較大（從初烤前的73.56%降至復烤后的52.1%），而子囊菌門相對豐度上升幅度較大（從初烤前的26.21%上升至復烤后的47.26%），這與Chen等［17］研究發現烘烤過程中子囊菌門相對豐度下降幅度較大，而擔子菌門相對豐度變化不明顯的研究結果不一致，造成此差異的原因可能是本研究中樣品煙葉生長的地理環境和樣品處理方式與Chen等［17］的研究不同。此外，本研究中在屬水平上Sampaiozyma、曲 霉 屬（Aspergillus）和 鏈 格 孢 屬（Alternaria）是優勢菌屬；這與陳乾麗等［10］發現曲霉屬和鏈格孢屬是初烤后煙葉中的優勢屬和Zhou等［18］發現在陳化初期煙葉中Sampaiozyma 是優勢菌屬的結論基本一致。相比初烤和復烤前后的細菌群落［4，18-20］，真菌群落的變化較小，相對穩定，這與Hu等［21］研究結果相似。Welty等［8，22］把收獲前侵入到煙草中的真菌定義為“田間真菌”，在收獲后侵入的真菌稱為“儲藏真菌”，且田間真菌很少感染煙草，而儲藏真菌（主要是曲霉菌和青霉菌）在收獲后侵入煙草。Christensen 等［23］和Tuite 等［24］的研究也證實，曲霉和青霉等會在收獲后侵入，導致谷物變質。在本研 究 中，曲 霉 屬（Aspergillus）、帚 枝 霉 屬（Sarocladium）、節擔菌屬（Wallemia）、枝頂孢霉屬（Acremonium）和根霉屬（Rhizopus）等致霉真菌是初烤后在煙葉上顯著富集的菌群，而青霉屬（Penicillium）主要是在復烤階段顯著富集。本研究中功能預測結果表明，煙葉在初烤后腐生菌群相對豐度升高，復烤前相對豐度最高。曲霉屬和青霉屬為常見腐生真菌［15，25］，后期腐生菌群的增加可能是由曲霉和青霉的富集引起。上述研究結果均表明曲霉和青霉等致霉真菌是在收獲后侵入煙草，這與Welty等［22］的結論一致，尤其是初烤后至復烤前，復雜的環境增加了致霉真菌侵入的可能性，未來可加強此期間的霉變防治。然而，曲霉和青霉等作為常見致霉真菌，其致霉機制還鮮見報道，未來可深入研究。此外，本研究中擔子菌門微球黑粉菌綱的Sampaiozyma優勢地位明顯。有研究［26-28］證明其為土壤及湖泊的沉積物中的野生酵母，能產生脂肪酶和果膠酶等胞外酶，但其在煙葉中的功能和特性鮮見報道，可進一步研究。

4 結論

采用高通量測序技術分析了4個加工階段（初烤前、初烤后、復烤前和復烤后）煙葉樣品的真菌群落，分析結果表明4個加工階段煙葉的真菌群落結構存在明顯差異：初烤前主要菌屬為Symmetrospora、Sampaiozyma、枝孢菌屬（Cladosporium）和布勒擲孢酵母屬（Bullera），初烤后主要菌屬為未分類亞隔孢殼科（Didymellaceae）真菌、Sampaiozyma、鏈格孢屬（Alternaria）和尾孢菌屬（Cercospora）；復烤前主要菌屬為曲霉屬（Aspergillus）、Sampaiozyma 和根霉屬（Rhizopus），復烤后主要菌屬為曲霉屬（Aspergillus）、Sampaiozyma 和未分類亞隔孢殼科（Didymellaceae）真菌。其中Sampaiozyma是共有優勢菌屬，在4個加工階段的相對豐度分別為44.27%、37.87%、24.12%和46.12%。曲霉屬（Aspergillus）是復烤階段優勢屬，其相對豐度初烤前為0.05%，而復烤前和復烤后的相對豐度分別為60.82%和25.78%。