四川雪茄煙葉在成熟與晾制和發(fā)酵過程中煙草特有亞硝胺的積累動(dòng)態(tài)

孫雨琦，張藍(lán)月，劉德水，秦艷青，趙園園，王 俊，張瑞娜，馬雁軍，李晶晶，周 駿，史宏志*

1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院 煙草農(nóng)業(yè)減害研究中心，鄭州市文化路95 號(hào) 450002

2. 上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠有限公司，北京市通州區(qū)萬盛南街99 號(hào) 100024

3. 中國煙草總公司四川省公司，成都市高新區(qū)世紀(jì)城路936 號(hào) 600041

4. 四川省煙草公司德陽市公司，四川省德陽市什邡回鎮(zhèn)青雀路30 號(hào) 618400

煙草特有亞硝胺（Tobacco specific nitrosamines，TSNAs）是由煙草生物堿與含氮氧化物發(fā)生亞硝化反應(yīng)生成的存在于煙葉和煙氣中的一類有害成分，包括亞硝基降煙堿（NNN）、4-（N-甲基亞硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）、亞硝基新煙草堿（NAT）和亞硝基假木賊堿（NAB）4 種［1］。研究表明，雪茄煙葉TSNAs含量相對(duì)較高，直接影響雪茄煙葉及其制品的安全性［2-4］。生物堿和亞硝酸鹽是TSNAs形成的直接前體物，煙葉中TSNAs的形成和積累與兩者含量關(guān)系密切［5］。TSNAs的形成和抑制技術(shù)一直是煙草研究的熱點(diǎn)，楊煥文等［6］研究表明，TSNAs 主要在晾曬煙的變黃期形成；孫榅淑等［7］研究也認(rèn)為，白肋煙等晾曬煙的調(diào)制階段和調(diào)制后的貯藏階段均是TSNAs 形成的重要時(shí)期；王娜［8］試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，烤煙TSNAs 的形成和積累主要發(fā)生在煙葉調(diào)制時(shí)期的變黃階段。通過降低TSNAs合成的前體物生物堿和硝酸鹽含量［9］、優(yōu)化生物堿組成［10］、控制煙葉調(diào)制過程中溫濕度、減少微生物活動(dòng)［6］，以及適當(dāng)降低煙葉貯藏溫度、增加煙葉含水率、抑制氣態(tài)氮氧化物的生成等均可有效降低TSNAs 的形成和積累［11-12］。雪茄煙葉的生產(chǎn)除調(diào)制外還需要經(jīng)過特有的發(fā)酵過程。雪茄煙葉的發(fā)酵階段是品質(zhì)形成的延續(xù)，發(fā)酵過程中煙葉化學(xué)成分逐漸發(fā)生變化，煙葉外觀品質(zhì)及內(nèi)在品質(zhì)進(jìn)一步提升［13］。Di 等［14］研究表明，雪茄煙葉的發(fā)酵階段由于生物酶的催化作用，會(huì)將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，再與生物堿發(fā)生亞硝化反應(yīng)，從而生成TSNAs。因此發(fā)酵階段可能也是雪茄煙葉TSNAs 形成的重要時(shí)期［15］。但有關(guān)雪茄煙TSNAs形成的關(guān)鍵時(shí)期以及不同時(shí)期對(duì)TSNAs總量的貢獻(xiàn)度目前尚不清楚。為此，測(cè)定了茄衣和茄芯兩種雪茄煙葉成熟、調(diào)制和發(fā)酵過程中TSNAs、生物堿、硝酸鹽含量的變化和積累量，旨在探討TSNAs 在不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)的形成規(guī)律，為生產(chǎn)上采取有效措施抑制TSNAs形成、降低雪茄煙葉有害物質(zhì)含量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)及材料

試驗(yàn)于2020年在四川省什邡市馬祖鎮(zhèn)進(jìn)行。試驗(yàn)田前茬作物為水稻，土壤有機(jī)質(zhì)3.01 g·kg-1，堿解氮120 mg·kg-1，速效鉀89 mg·kg-1，速效磷38.1 mg·kg-1，pH 5.8～7.0。本試驗(yàn)中將德雪3 號(hào)作為茄衣品種，當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)主栽品種什煙1號(hào)作為茄芯品種。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

德雪3號(hào)及什煙1號(hào)的試驗(yàn)田面積均為333.34 m2，煙苗于5月1日移栽，行距125 cm，株距40.5 cm。按照當(dāng)?shù)厣a(chǎn)技術(shù)規(guī)范統(tǒng)一進(jìn)行田間管理，煙田氮用量為180 kg·hm-2，m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）= 1∶0.5∶3。調(diào)制方式為晾制（晾制設(shè)施為鋼結(jié)構(gòu)現(xiàn)代化晾房，煙葉成熟時(shí)單片采收，晾制時(shí)間為25 d，在晾制過程中根據(jù)天氣情況加溫通風(fēng)，晾制期間晾房平均溫度為24.6 ℃，平均相對(duì)濕度為78.1%）。發(fā)酵方式為堆積發(fā)酵，發(fā)酵煙堆正中心放置溫度計(jì)，監(jiān)測(cè)溫度。煙堆外用麻袋片進(jìn)行覆蓋，經(jīng)過1周左右且溫度達(dá)到55 ℃時(shí)進(jìn)行翻堆。

煙葉在成熟采收前均選取大田長(zhǎng)勢(shì)和葉片成熟度相對(duì)一致的200株煙進(jìn)行掛牌標(biāo)記、定株，試驗(yàn)過程中對(duì)兩個(gè)品種雪茄煙葉分不同時(shí)期、不同部位進(jìn)行取樣，均隨機(jī)選取掛牌的20株煙葉。采收前期、晾制期和發(fā)酵期的取樣部位均為中部葉及上部葉，每個(gè)部位各取5片煙葉。采收前取樣時(shí)間為中部葉及上部葉未達(dá)到生理成熟前（生青）進(jìn)行第1次取樣，葉片由下向上逐漸成熟，待中部葉及上部葉達(dá)到適宜成熟度時(shí)分別進(jìn)行第2次取樣；晾制時(shí)期取樣時(shí)間為變黃末期第1 次取樣、變褐末期第2 次取樣、干筋末期第3次取樣。發(fā)酵時(shí)期取樣時(shí)間為每次翻堆時(shí)取1次樣，至發(fā)酵結(jié)束共取樣4次。所取煙葉樣品經(jīng)過冷凍干燥后磨碎過篩（孔徑0.25 mm），測(cè)定煙葉中TSNAs 及其前體物含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），每樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 TSNAs含量測(cè)定

由上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠有限公司測(cè)定雪茄煙葉TSNAs含量。測(cè)定方法為固相萃取液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（SPE-LC-MS/MS）法［在線SPE 系 統(tǒng)：Symbiosis（Pico），荷蘭Spark Holland 公司；質(zhì)譜儀：AB SCIEX Triple Quad 5500，AB Sciex公司］。稱取1.0 g 煙樣，置于50 mL 錐形瓶中，加入40 μL 的4 種氘代TSNAs（內(nèi)標(biāo)）溶液（5 000 ng/mL）和30 mL 的100 mmol/L 乙酸銨水溶液，在室溫下振蕩萃取（200 r/min，60 min），萃取液過0.45 μm 水相濾膜后，用LC-MS/MS 檢測(cè)萃取液中煙草特有亞硝胺含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）［16］。NNN、NNK、NAT 和NAB 含量之和為TSNAs總量［8］。

1.3.2 生物堿含量測(cè)定

采用氣相色譜法，將雪茄煙葉樣品凍干后粉碎，過250 μm 篩。稱取200 mg 煙末置于15 mL 旋蓋培養(yǎng)試管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液（7.5 μg/μL正十六烷內(nèi)標(biāo)溶液）100 μL，10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）NaOH溶液1.5 mL，甲基叔丁基醚3 mL，旋緊旋蓋，振蕩5 min 后，室溫放置22～26 h 后提取上層清液通過7890A 型氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器（美國Agilent公司）定量分析4種生物堿（煙堿、降煙堿、假木賊堿和新煙草堿）含量，計(jì)算其含量之和為總生物堿含量，并計(jì)算煙堿轉(zhuǎn)化率。

煙堿轉(zhuǎn)化率=［降煙堿含量/（煙堿含量+降煙堿含量）］×100%

1.3.3 硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量測(cè)定

采用濃H2SO4水楊酸法測(cè)定煙葉硝態(tài)氮（NO3--N）含量［17］。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 與SPSS 22.0 軟件進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析，用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，采用Excel 2010和Origin 8.0軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 雪茄煙葉不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)TSNAs含量的動(dòng)態(tài)變化

2.1.1 德雪3號(hào)不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)TSNAs含量的動(dòng)態(tài)變化

德雪3 號(hào)中部葉和上部葉在不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)TSNAs含量動(dòng)態(tài)變化見圖1。可以看出，德雪3號(hào)中部葉及上部葉在采收前、晾制期和發(fā)酵期TSNAs 含量的變化規(guī)律基本一致，即葉片中NNN、NAT、NAB、NNK 和TSNAs 總量在采收前積累量較少，而晾制期和發(fā)酵期積累量持續(xù)增加。其中，NNN采收前的積累比例為16.01%～16.52%，晾制期的積累比例為30.39%～38.81%，發(fā)酵期的積累比例為45.18%～53.10%；NAT 和NAB 采收前的積累比例為5.24%～11.09%，晾制期的積累比例為26.12%～56.21%，發(fā)酵期的積累比例為38.17%～68.65%；NNK 成熟采收前的積累比例為15.98%～22.40%，晾制期的積累比例為45.42%～48.32%，發(fā)酵期的積累比例為30.65%～35.70%；TSNAs 總量采收前積累比例為10.98%～11.12%，晾制期的積累比例為30.65%～42.73%，在發(fā)酵期的積累比例為46.29%～58.23%。

2.1.2 什煙1號(hào)不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)TSNAs含量的動(dòng)態(tài)變化什煙1 號(hào)中部葉和上部葉在不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)TSNAs含量動(dòng)態(tài)變化見圖2。可以看出，什煙1號(hào)中部葉及上部葉中NNN、NAT、NAB、NNK 含量和TSNAs 總量在采收前、晾制期和發(fā)酵期呈持續(xù)增加趨勢(shì)，且采收前積累量較少，晾制期和發(fā)酵期積累量較多，與德雪3 號(hào)在不同時(shí)期TSNAs 的積累規(guī)律一致。NNN成熟采收前的積累比例為3.03%～11.47%，晾制期的積累比例為45.52%～49.58%，發(fā)酵期的積累比例為38.94%～51.44%；NAT 和NAB 成熟采收前的積累比例為15.38%～20.39%，晾制期的積累比例為35.95%～58.40%，發(fā)酵期的積累比例為26.22%～44.23%；NNK采收前的積累比例為13.48%～14.45%，晾制期的積累比例為39.17%～48.13%，發(fā)酵期的積累比例為38.39%～46.38%；TSNAs 總量采收前的積累比例為5.91%～14.02%，晾制期的積累比例為45.26%～48.22%，在發(fā)酵期的積累比例為40.71%～45.87%。

圖2 什煙1號(hào)不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)TSNAs含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic variations of TSNA contents in Shiyan 1 at different production stages

2.2 雪茄煙葉不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)生物堿含量的動(dòng)態(tài)變化

德雪3 號(hào)及什煙1 號(hào)中部葉和上部葉在不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)生物堿含量動(dòng)態(tài)變化見圖3 和圖4。可以看出，兩種雪茄煙葉中均以煙堿含量最高，假木賊堿含量最低。德雪3 號(hào)在采收時(shí)的煙堿含量為2.87%～3.71%，在晾制末期含量為2.35%～3.27%，在發(fā)酵末期含量為1.80%～2.60%；什煙1號(hào)在采收時(shí)的煙堿含量為5.01%～5.34%，在晾制末期含量為2.50%～2.80%，在發(fā)酵期末期含量為1.48%～1.99%。兩個(gè)品種雪茄煙葉中煙堿及總生物堿含量均在采收前大量積累，在晾制和發(fā)酵環(huán)節(jié)呈持續(xù)下降趨勢(shì)。

圖3 德雪3號(hào)不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)生物堿含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic variations of alkaloid contents in Dexue 3 at different production stages

圖4 什煙1號(hào)不同生產(chǎn)環(huán)節(jié)生物堿含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic variations of alkaloid contents in Shiyan 1 at different production stages

2.3 雪茄煙不同時(shí)期TSNAs、生物堿和NO-N 含量比較

在成熟末期、晾制末期、發(fā)酵末期對(duì)德雪3 號(hào)及什煙1號(hào)煙葉TSNAs、生物堿和NO-N 含量進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果見表1。可以看出，兩種雪茄煙葉TSNAs 總量在成熟、晾制和發(fā)酵過程中均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，且晾制末期TSNAs總量顯著高于成熟末期，發(fā)酵末期TSNAs總量顯著高于晾制末期；煙堿、生物堿總量在成熟、晾制和發(fā)酵過程中呈下降趨勢(shì)，且成熟末期含量顯著高于晾制末期，晾制末含量顯著高于發(fā)酵末期；NO-N 含量在成熟、晾制和發(fā)酵過程中呈下降趨勢(shì)，且成熟末期含量最高，顯著高于發(fā)酵末期，這可能是由于在晾制和發(fā)酵過程中微生物活性增強(qiáng)，將硝酸還原成了亞硝酸。

表1 雪茄煙葉不同時(shí)期TSNAs、生物堿和NO-N含量比較①Tab.1 Contents of TSNAs, alkaloids and NO-N in cigar tobacco at different stages

表1 雪茄煙葉不同時(shí)期TSNAs、生物堿和NO-N含量比較①Tab.1 Contents of TSNAs, alkaloids and NO-N in cigar tobacco at different stages

（部位） 時(shí)期 TSNAs/（ng·g-1）NNN NAT NAB NNK 總量品種生物堿/%煙堿 降煙堿 假木賊堿 新煙草堿 總量NO3--N/（μg·g-1）德雪3號(hào)（中部葉）德雪3號(hào)（上部葉）成熟末期晾制末期發(fā)酵末期成熟末期晾制末期發(fā)酵末期124.25c 352.82b 752.26a 70.30c 240.76b 439.21a 45.85c 274.54b 875.62a 46.66c 390.95b 781.60a 2.34b 10.90b 21.11a 1.08b 11.85b 19.16a 35.82b 144.10a 224.10a 35.49b 107.46a 158.46a 208.26c 782.36b 1 873.09a 153.53c 751.03b 1 398.42a 2.87a 2.35b 1.80c 3.71a 3.17b 2.59c 0.14a 0.10a 0.09b 0.13a 0.13a 0.13a 0.02a 0.02a 0.02a 0.02a 0.02a 0.02a 0.27a 0.17a 0.22a 0.25a 0.23a 0.18b 3.29a 2.64b 2.13c 4.11a 3.66b 2.93c 5 128.36a 3 349.25b 1 973.13c 2 588.06a 1 862.29b 1 128.36c

表1（續(xù)）

3 討論

晾制及發(fā)酵環(huán)節(jié)是雪茄煙葉外觀質(zhì)量及內(nèi)在品質(zhì)形成的重要時(shí)期［12］。本研究中發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)也是TSNAs形成積累的關(guān)鍵時(shí)期。晾制前的雪茄煙葉中TSNAs 積累量較小，這主要是由于細(xì)胞的完整性使TSNAs 的合成前體物相互隔離，不能聚合在一起發(fā)生反應(yīng)。雪茄煙葉在晾制過程中TSNAs的形成可能與微生物的活動(dòng)密切相關(guān)。對(duì)白肋煙晾制過程中TSNAs 形成規(guī)律和機(jī)理的研究表明，煙葉變黃末期是TSNAs形成的主要時(shí)期，在晾制過程中，煙葉組織水分散失，細(xì)胞膜逐漸破壞，膜的通透性加大，細(xì)胞內(nèi)含物外滲，導(dǎo)致微生物大量繁殖，使硝酸還原為亞硝酸，進(jìn)而與生物堿發(fā)生亞硝化反應(yīng)生成TSNAs［18-19］。在雪茄煙葉調(diào)制過程中TSNAs的形成也主要發(fā)生在煙葉的變黃期和褐變期，關(guān)于調(diào)制過程中煙葉表面微生物的變化及與調(diào)制環(huán)境的關(guān)系尚需進(jìn)一步試驗(yàn)。雪茄煙葉的發(fā)酵是在高溫和高濕條件下完成的，這種條件不僅可能造成微生物活動(dòng)增強(qiáng)，使硝酸還原為亞硝酸，也可能會(huì)導(dǎo)致高溫條件下煙葉硝酸鹽直接產(chǎn)生氣態(tài)氮氧化物。對(duì)貯藏過程中煙葉TSNAs 形成機(jī)理的研究表明，高溫條件下可通過化學(xué)作用使硝酸鹽直接產(chǎn)生氣態(tài)氮氧化物，進(jìn)而促使生物堿發(fā)生亞硝化反應(yīng)形成TSNAs［9，20］。雪茄煙葉發(fā)酵溫度、濕度和發(fā)酵周期均會(huì)影響雪茄煙葉TSNAs 形成［12，21］，因此雪茄煙葉發(fā)酵過程中TSNAs的形成機(jī)理較復(fù)雜，闡明其作用機(jī)理，明確微生物和溫濕度條件對(duì)TSNAs 積累的貢獻(xiàn)，有效降低發(fā)酵過程中TSNAs 的形成和積累以及采取有效措施抑制TSNAs形成等方面仍有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

雪茄茄衣和茄芯煙葉在成熟、調(diào)制和發(fā)酵過程中各TSNAs組分和TSNAs總量積累差異較小，均表現(xiàn)為成熟采收前TSNAs 的積累比例較小，晾制和發(fā)酵期時(shí)期TSNAs積累比例較大。在晾制和發(fā)酵環(huán)節(jié)茄衣品種德雪3 號(hào)TSNAs 總量的積累比例分別為30.65%～42.73%和46.29%～58.23%，茄芯品種什煙1號(hào)TSNAs總量的積累比例分別為45.26%～48.22%和40.71%～45.87%。因此，晾制及發(fā)酵環(huán)節(jié)是雪茄茄衣和茄芯煙葉TSNAs形成的關(guān)鍵時(shí)期。