大花卷丹百合組培快繁技術研究

朱巖 王紅 代寧 鄭敏學 楊蕾 馬艷麗

摘要：為獲得大花卷丹百合的優質種苗，促進其規模化生產，以大花卷丹百合的鱗片為外植體，采用MS、N6、B5培養基，添加激素NAA、6-BA、GA3，進行了大花卷丹百合的快繁技術研究。結果表明，外植體在N6培養基中產生愈傷組織最快、效果最好。愈傷組織及不定芽誘導最佳培養基配方為N6+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA;不定芽增殖最佳培養基為N6+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3。NAA誘導小鱗莖效果最佳，最適培養基為 N6+1.0 mg/L NAA;促進小鱗莖膨大生根要在誘導鱗莖的基礎上加入IBA，即最適培養基為N6+0.1 mg/L NAA+2.0 mg/L IBA。

關鍵詞：大花卷丹百合;組織培養;快繁技術

中圖分類號：S682.2? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1001-1463（2022）09-0076-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2022.09.018

Study on Techniques of Rapid Propagation for the Tissue Culture of Lilium leichtlinii var. maⅹimowiczii （Regel） Baker

ZHU Yan， WANG Hong， DAI Ning， ZHENG Minxue， YANG Lei， MA Yanli

（College of Landscape Architecture， Changchun University， Changchun Jilin 130012， China）

Abstract： To obtain the premium seedlings of Lilium leichtlinii var. maximowiczii（Regel） Baker and to promote its large-scale production， using scales as the explant， MS， N6 and B5 media with the addition of NAA， 6-BA and GA3 were applied to conduct the study on techniques of rapid propagation for the tissue culture of Lilium leichtlinii var. maximowiczii（Regel） Baker. Results showed that N6 medium was the quickest and the best medium to induce the callus formation， optimum medium for the induction of callus and adventitious buds was N6 plus 1.0 mg/L 6-BA plus 0.1 mg/L NAA. The optimum medium for adventitious bud proliferation was N6 plus 0.5 mg/L 6-BA plus 0.1 mg/L NAA plus 1.0 mg/L GA3. NAA showed the best effect in inducing small bulblets and the optimum medium was N6 plus 1.0 mg/L NAA whereas IBA ought to be added to promote the rooting of bulblet enlargement with the optimum medium selected as N6 plus 1.0 mg/L NAA plus 2.0 mg/L IBA.

Key words：? Lilium leichtlinii var. maximowiczii （Regel） Baker; Tissue culture; Rapid propagation technique

大花卷丹百合[Lilium leichtlinii var. maximowiczii （Regel） Baker]是百合科百合屬球根花卉，原產我國秦嶺山區、華北和東北地區，是一種觀賞價值較高的花卉。由于種球自毒的原因，組培擴繁是大花卷丹百合重要的繁殖方式，組培快繁體系有一定的基因差異性，因此，規模化生產需要建立高效的再生體系。成海鐘等[1 ]研究發現在培養基中添加0.1 mg/L 6-BA或KT可顯著提高百合繼代培養中芽的增殖效果，6-BA的效果優于KT的效果;石印等[2 ] 研究發現，大花卷丹組織培養啟動階段添加6-BA和NAA可獲得較好的不定芽誘導率，其中6-BA效果較明顯。大量研究證明，植物組織培養是植物繁育過程中高效、安全、可推廣得最適方法，探索大花卷丹百合組織培養最適宜培養基在實際生產中具有重要意義。

1? ?材料和方法

1.1? ?供試材料

供試大花卷丹百合鱗莖于2020年10月采自吉林省輝南縣博碩寒地花卉基地。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ? 試驗條件及外植體預處理? ? 組織培養室溫度控制在（25±1） ℃[3 ]，光周期為16 h光照/8 h黑暗，光強為1 500～2 000 lx，空氣相對濕度為65%。培養基中均添加30 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂，pH 5.8～6.2。每處理接種30個，設3次重復，下同。

將百合鱗片輕輕取下，用洗衣粉水浸泡20 min，自來水沖洗1 h。將外植體置于超凈工作臺上，用75%酒精消毒30 s后用去離子水漂洗3遍，再用0.1%升汞處理15 min，去離子水漂洗3遍，用無菌濾紙吸干表面水分，備用。

1.2.2? ? 外植體切割方式篩選? ? 在N6培養基中添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，制成誘導培養基。選取生長狀況良好的中部鱗片，經消毒處理后，將整個鱗片、半個鱗片、縱向長條鱗片（寬約0.10～0.15 cm）分別接種于誘導培養基上，培養20 d后觀察鱗片愈傷組織形成情況。實驗設置3次生物學重復。

1.2.3? ? 基礎培養基篩選? ? ?選用N6、MS、B5作為基礎培養基，添加相同濃度的6-BA（1.0 mg/L）和NAA（0.1 mg/L）。將消毒處理后的百合鱗片沿其縱軸方向切成寬0.10～0.15 cm的長條形小塊，接種于培養基上，記錄愈傷組織形成的時間及誘導出愈傷組織的數量。

1.2.4? ? 愈傷組織及不定芽誘導? ? ?以N6為基本培養基，添加不同濃度的NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L）和6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L），制成不同配比組合的誘導培養基。將消毒處理后的百合鱗片沿其縱軸方向切成寬0.10～0.15 cm的長條形小塊，接種于培養基中，先在黑暗條件下培養7 d，后轉入光下培養，18 d后統計愈傷組織及不定芽的誘導。

1.2.5? ?不定芽增殖培養? ? ?以N6為基本培養基，添加不同濃度的NAA（0.1、0.3 mg/L）、6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、GA3（0.5、1.0 mg/L），制成不同配比組合的增殖培養基。叢生芽長度約為2 cm時，將其切成單叢，接種在增殖培養基中，培養20 d后統計增殖倍數及生長情況。

1.2.6? ?小鱗莖誘導培養? ? ?以N6為基本培養基，添加不同濃度的NAA（0.5、1.0 mg/L）和6-BA（0、0.5 mg/L），制成不同配比組合的鱗莖誘導培養基。將叢生芽分割成合適的單叢，接種于鱗莖誘導培養基中，25 d后統計不定芽平均形成鱗莖數，記錄生長情況[4 ]。

1.2.7? ? 小鱗莖膨大生根培養? ? ?以N6為基本培養基，添加不同濃度的NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L）和IBA（1.0、1.5、2.0 mg/L），制成不同配比組合的生根培養基，將帶有小鱗莖的叢生芽接種于生根培養基中， 25 d后統計生根數并觀察記錄生長情況[5? ]。

1.3? ?數據統計方法

誘導率=（出芽外植體數/接種數）×100%;

增殖倍數=增殖總芽數/接種總芽數;

不定芽平均形成鱗莖數=不定芽形成的鱗莖總數/接種的不定芽總數;

數據采用Excel和SPSS 23進行分析。

2? ? 結果與分析

2.1? ?外植體切割方式誘導篩選

比較鱗片不同切割處理方式發現，相比整個鱗片或半個鱗片接種，按百合鱗片縱軸方向切成寬0.10～0.15 cm的長條形小塊可獲得更多的愈傷組織（表1）。

2.2? ?基礎培養基篩選

從表2可知，MS、N6、B5培養基均對愈傷組織的形成有一定的促進作用。其中N6作為基礎培養基對大花卷丹百合的誘導培養效果最好;其次是MS作為基礎培養基也可獲得較好的愈傷組織狀態，但愈傷組織形成的時間相對較長;B5作為基礎培養基，通常用作木本植物的組織培養中，在本試驗中的存活率及誘導愈傷組織的效果表現最差，不適宜大花卷丹百合快速繁育培養。

2.3? ?愈傷組織及不定芽誘導培養

在光培養下，外植體由白色逐漸轉為鮮綠色，經過18 d的培養，鱗片創口出長出淡黃綠色的愈傷組織，而后形成白綠色突起（圖1），28 d后突起處長出不定芽，后進行伸長生長（圖2）。其中N6+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培養基效果最好，誘導率達73.30%，與其他培養基差異顯著（表3）。即當添加1.0 mg/L 6-BA 、0.1 mg/L NAA時，最適宜大花卷丹百合誘導愈傷組織及小鱗莖。

2.4? ? 不定芽增殖培養

從圖3可以看出，接種20 d后，叢生芽可見到明顯增殖，不同濃度及配比的6-BA、NAA、GA3對大花卷丹百合叢生芽增殖的影響差異顯著（表4）。其中N6+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3增殖倍數最高，為2.73倍，且與其他處理差異均顯著。即N6+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+ 1.0 mg/L GA3為大花卷丹百合最適宜的增殖培養基。

2.5? ? 小鱗莖誘導培養

叢生芽分株后的單芽，經小鱗莖培養基培養25 d左右膨大并形成小鱗莖，其中N6 + 1.0 mg/L NAA處理誘導小鱗莖數個數最多，為5.56個，且與其他處理差異均顯著。即基礎培養基中只添加1.0 mg/L NAA，可獲得最好的小鱗莖增殖效果（圖4、表5）。

2.6? ?小鱗莖膨大生根培養

小鱗莖在膨大及生根培養基中12 d左右開始生根，21 d生根完成，對表6數據分析可知，NAA濃度為0.1 mg/L時，隨著IBA濃度不斷增加，小鱗莖膨大效果逐漸變好，且根系生長狀態也轉好（圖5）。即當IBA濃度為2.0 mg/L、NAA濃度為0.1 mg/L時，最適宜大花卷丹百合小鱗莖膨大及生根培育。

2.7? ?組培苗移栽

對組培苗進行煉苗移栽，約8 d后開始長出新葉（圖6），成活率達90%以上。

3? ?結論與討論

快速繁殖體系的建立對規范百合工廠化繁育流程、脫毒材料及種質資源保存都具有重大意義。不同種類百合的形態特征、生理特性、器官的發生發育都存在著極大差異，這也直接導致了不同百合快速繁殖體系的建立擁有不同的培育方式及配方。如潘佑找等[6 ]研究發現百合外植體不同部位分化能力存在差異，其差異由強到弱為：鱗片、根、葉片。樊敏等[7 ]用蘭州百合不同外植體進行了組織培養試驗，獲得了較完善的數據。而本試驗僅以鱗片為外植體，重點研究大花卷丹組織培養不同階段的最佳培養基，而不同外植體對其影響，有待進一步試驗。試驗結果表明，在激素種類含量相同的條件下，將大花卷丹鱗莖處理后分別接入MS、B5和N6的培養基中，經觀察發現，外植體在N6培養基中產生愈傷組織最快、效果最好。愈傷組織及不定芽的誘導最佳培養基配方為N6+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，不定芽增殖效果最佳的培養基為N6+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3，誘導小鱗莖最佳培養基為 N6+1.0 mg/L NAA，小鱗莖膨大生根培養時要在誘導鱗莖的基礎上加入IBA以促進生根，最適培養基為N6+0.1 mg/L NAA+2.0 mg/L IBA。在以百合鱗莖為外植體建立快繁體系時，對于鱗片外植體的切割方式并沒有過于嚴格的要求，一般將鱗片消毒處理后一分為二接種到相應培養基中。在本試驗發現，將鱗片按照其縱軸方向切割成寬約0.10～0.15 cm的長條形外植體材料，可獲得更好的愈傷組織增殖效果，且愈傷組織極易形成叢生芽，這在實際生產中可極大地減少原材料的成本。

大花卷丹百合自外植體接入培養基后，先是產生愈傷組織，而后在愈傷組織處，形成不定芽，不定芽經擴增繁殖后，在小鱗莖膨大培養基的作用下[8 ]，基部逐漸膨大，進而形成籽球，經過生根培養，小籽球產生一定的根系后，便可進行煉苗移栽，直至形成完整植株。

本研究以大花卷丹百合的鱗片為外植體，經過約120 d培養，最終建立了大花卷丹百合的快繁體系。使用最佳配方的繁殖系數最高可達25.49，這相對于自然繁殖，繁殖率大大提高，同時也縮短了培育時間。

參考文獻：

[1] 成海鐘，唐? ?蓉，朱旭東，等.? 幾種生長調節劑對觀賞百合繼代培養中芽增殖效果的影響[C]// 浙江省科學技術協會.? 首屆長三角園藝論壇論文集. 杭州：[出版者不詳]，2007：234-236.

[2] 石? ?印， 向圓媛， 孫? ?明.? 大花卷丹離體培養快速繁殖體系的建立[J].? 河南農業科學， 2013，42（1）：98-101.

[3] 林玉紅.? 氣溫對蘭州百合鱗莖粗淀粉累積含量的影響[J].? 甘肅農業科技，2022，53（1）：68-72.

[4] 蔡文燕， 李媛媛， 張澤宏，等.? 水仙屬植物的組織培養研究進展[J].? 閩南師范大學學報（自然科學版）， 2021，34（4）：84-91.

[5] 李艷敏， 張? ?晶， 王朝陽，等. 渥丹組織培養技術研究[J].? 江蘇農業科學，2020，48（19）：52-55.

[6] 潘佑找， 柯尊濤， 趙宇瑛.? 不同外植體對蘭州百合組織培養的影響[J].? 安徽農學通報， 2007，13（19）：242-245.

[7] 樊? ?敏， 唐亞玲， 王? ?莉，等.? 蘭州百合不同外植體植物組織培養[J].? 農業與技術，2021，41（18）：26-28.

[8] 裴懷弟，林玉紅，李淑潔，等.? 蘭州百合組培小鱗莖誘導技術研究[J].? 甘肅農業科技，2019（7）：29-32.