絨毛白蠟松散型胚性愈傷組織的誘導

董洪雨 許丁帆 易元慧 何遠秦 李得萍 劉艷軍

摘? ? 要：以絨毛白蠟組培苗莖段為外植體，建立絨毛白蠟松散型胚性愈傷組織誘導體系，為絨毛白蠟遺傳轉化與離體誘變等研究奠定基礎。試驗結果顯示：幼嫩莖段在WPM+0.5 mg·L-1 2，4-D + 5 mg·L-1 GA3 + 30 g·L-1蔗糖的培養基上可誘導出理想的松散型愈傷組織;將松散型愈傷組織在MS + 0.5 mg·L-1 2，4-D + 1.0 mg·L-1 KT + 30 g·L-1蔗糖的培養基上繼代培養，每15 d繼代1次，繼代時選擇結構松散質地較硬的愈傷組織，3次繼代培養后，可獲得絨毛白蠟松散型胚性愈傷組織。

關鍵詞：絨毛白蠟 ;松散型胚性愈傷組織;組織培養

中圖分類號：S722.3+7? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.05.002

Study on the Induction of Loose Embryogenic Callus from Fraxinus velutina Torr

DONG Hongyu， XU Dingfan， YI Yuanhui， HE Yuanqin， LI Deping， LIU Yanjun

（School of Horticulture and Landscape Architecture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300392， China）

Abstract： Using the stem segments of tissue cultured seedlings of Fraxinus velutina Torr， as explants， the loose embryogenic callus induction system of Fraxinus velutina was established， which laid a foundation for the study of genetic transformation and in vitro mutagenesis of Fraxinus velutina. The results showed that the young stem segments could induce ideal Loose callus on the medium of WPM+ 0.5 mg·L-1? 2，4-D+5 mg·L-1? GA3+30 g·L-1? sucrose; The loose callus was subcultured on the medium of MS+0.5 mg·L-1? 2，4-D+1.0 mg·L-1? KT+30 g·L-1? sucrose， and subcultured once every 15 days. The callus with loose structure and hard texture was selected during subculture. After subculture for 3 times， the loose embryogenic callus of Fraxinus velutina Torr could be obtained.

Key words： Fraxinus velutina; loose embryogenic callus; tissue culture

絨毛白蠟（Fraxinus velutina）為木犀科（Oleaceae）白蠟屬（Fraxinus）落葉喬木，樹體高大，枝節粗壯，抗逆性強，是防風固沙的重要樹種[1]。目前，絨毛白蠟以種子繁殖、扦插繁殖為主要繁殖方式，受時間和環境條件的影響較大，繁殖效率較低。利用植物組織培養技術可以顯著縮短繁殖周期，同時還能保持親本的優良特性[2]。

植物組織培養技術與傳統的植物繁殖技術相比，植物組織培養技術不僅節省繁殖材料，而且促進植株的生長發育、人為調控影響植株的因素使其植株處于最佳狀態[3]。松散型胚性愈傷組織是經過人工誘導產生的一種特殊的植物組織類型，這種組織主要由彼此聯系松散的愈傷組織細胞構成，而愈傷組織細胞的特點是其具有一定的胚性，即這些細胞可以在一定條件下經過分化與分裂，逐步發育成胚狀體。這類細胞在組培快繁、體細胞誘變育種、遺傳轉化和植物組織脫毒培養方面都有良好的應用前景，并存在較強的技術優勢，而且具有很強的體細胞胚發生和植株再生能力[4]。

關于白蠟屬的研究，其他學者也有一定的進展。他們在白蠟屬中成功誘導出愈傷組織的有美國白蠟[5]，水曲柳[6-7]，對節白蠟[8-9]等。在白蠟組織培養技術中，已見種子[10]、莖段[11-12]等作為外植體進行白蠟愈傷組織誘導的報道。在絨毛白蠟組織培養研究中，寧苓等[13]和許丁帆等[14]以幼嫩莖段為材料建立組織培養快速繁育體系;燕麗萍等[15]利用胚根誘導絨毛白蠟體細胞胚發生，建立再生體系。但至今沒有人采用松散型愈傷組織培育絨毛白蠟完整植株。

本試驗以絨毛白蠟組培苗莖段為外植體，在不同培養基上誘導愈傷和胚性愈傷組織，并結合顯微鏡觀察及繼代選擇，最終建立其穩定的絨毛白蠟松散型胚性愈傷組織誘導體系。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的絨毛白蠟組培苗由天津農學院園林植物實驗室提供。組培苗所用的繼代培養基為MS培養基。

1.2 試驗方法

1.2.1 絨毛白蠟松散型愈傷組織誘導 將絨毛白蠟組培苗剪成5～7 mm的幼嫩莖段，將其接種到事先配制的愈傷組織誘導培養基上，本試驗采用不同基本培養基，同時附加不同的植物激素，配成誘導培養基，每個品種接種10塊外植體，每個處理設置3次重復。將接種好的三角瓶放到培養室中進行培養，其培養的條件為：采用連續光照，光照強度為1 000 lx，培養溫度為24±2 ℃。培養時間為40 d，最后統計每種處理的試驗結果。

1.2.2 松散型胚性愈傷組織誘導 將上一步驟誘導出的白色、松散的愈傷組織從三角瓶中取出，在超凈臺中，用鑷子分成大小約0.25 cm3的愈傷組織塊，將愈傷組織團接種到事先配制的培養基上。試驗用的基本培養基為MS培養基，并添加不同種類與濃度的激素。每個試驗處理重復5次，每瓶接種8塊外植體。培養條件與前面相同，溫度改為22±2 ℃，經過10 d的培養，將每個處理的愈傷組織采用相同的培養基進行繼代培養，最后把每個試驗處理的愈傷組織的誘導結果進行統計記錄。

1.3 統計分析

愈傷組織誘導率%=（誘導出愈傷組織的外植體數/接種外植體數）×100%;

試驗數據采用Excel 2013和SPSS Statistic 17.0進行數據分析，Duncans新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 絨毛白蠟愈傷組織誘導結果

將絨毛白蠟莖段外植體接種到愈傷組織誘導培養基上后，每天觀察愈傷組織誘導情況。隨著時間的延長，在不同處理的外植體上出現明顯的差異，具體結果見表1。

從表1可以看出，不同培養基上絨毛白蠟愈傷組織誘導的情況明顯不同，首先從愈傷組織誘導率來看，采用MS和B5作為基本培養基，愈傷組織誘導率都不太高，說明這兩種培養基都不適合愈傷組織的誘導。然而采用WPM作為基本培養基時，不論2，4-D的濃度是0.5 mg·L-1還是1.0 mg·L-1，這時愈傷組織的誘導率都可以達到100%，說明WPM適合白蠟愈傷組織的誘導，適合組培苗的生長;其次，從愈傷組織生長來看，不同基本培養基上愈傷組織生長情況也不同。當培養基中只加入2，4-D時，3種基本培養基上誘導出的愈傷組織都生長緩慢，只是在WPM和B5上愈傷組織是白色緊密型的類型，而MS上是白色半透明，并且隨著2，4-D濃度增加，愈傷組織出現褐變現象，說明在MS中增加2，4-D濃度會對愈傷組織產生強烈的毒害作用。而白色緊密型愈傷組織對于胚性愈傷組織的誘導不利，一般很難從這種愈傷組織誘導出胚性愈傷（圖1-A）。因此，本試驗通過調整試驗方案，在培養基中加入了GA3來增加外植體的生理活性，使得愈傷組織生長速度增快，從而在愈傷組織類型上有所改變。試驗結果顯示在WPM+0.5 mg·L-1 2，4-D+5 mg·L-1 GA3的培養基上愈傷組織生長速度明顯增快，同時，松散型愈傷組織也可以誘導出來，這類組織進一步誘導很容易獲得胚性愈傷組織。當采用更高濃度的GA3時，愈傷組織生長速度不但沒有增快，相反出現褐變現象，這說明過高濃度對愈傷組織產生了毒害作用，因此綜上試驗結果，誘導白蠟愈傷組織的理想培養基配方為：WPM+0.5 mg·L-1 2，4-D+5 mg·L-1 GA3+30 g·L-1蔗糖。

2.2 絨毛白蠟胚性愈傷組織誘導的結果

從表2可以看出，在不同激素配比條件下，絨毛白蠟愈傷組織胚性化誘導結果不同。首先，單獨使用2，4-D時，雖然愈傷組織可以生長，但速度較慢，而且愈傷組織逐漸變硬，結構也變得緊密，單獨使用2，4-D不能誘導白蠟愈傷組織胚性化;當使用0.5 mg·L-1 2，4-D與0.5 mg·L-1 BA和KT配合使用時，愈傷組織生長速度還是較慢，愈傷組織硬并且結構緊密，愈傷組織很難胚性化;當采用 0.5 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 BA培養基時，愈傷組織生長較快，質地與結構也都與胚性愈傷組織相似，通過鏡檢發現，一部分愈傷組織細胞呈現球型、細胞質濃、細胞核明顯，細胞分裂旺盛，屬于胚性細胞（圖1-B），但多數是一些具有較大液泡的薄壁細胞，這說明該配方可以誘導絨毛白蠟愈傷組織轉變為胚性愈傷，只是效果較差;當采用0.5 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 KT時，愈傷組織結構松散、質地較硬，通過顯微鏡觀察發現細胞大多呈球形，細胞核明顯，屬于胚性愈傷組織細胞（圖1-C），說明該配方適合誘導絨毛白蠟愈傷組織往胚性愈傷組織轉變;當提高2，4-D濃度并采用較低濃度的BA和KT時，愈傷組織生長速度較快，但質地較軟，通過鏡檢發現只有少數細胞為胚性細胞;當采用1.0 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 KT和1.0 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 BA時，誘導效果并不理想，經過多次繼代培養，愈傷組織仍然是非胚性狀態，這說明較高濃度2，4-D抑制了愈傷組織向胚性化轉變。為此，試驗采用了較高濃度KT的配方：0.5 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 KT，經過2次繼代培養后這時其誘導的愈傷組織，通過顯微鏡可以看到，愈傷組織細胞基本轉變為胚性細胞，因此選用此培養基配方可以獲得理想的絨毛白蠟胚性愈傷組織。

3 結論與討論

培養基的組成對誘導絨毛白蠟胚性愈傷組織的影響較大。本試驗3種基本培養基中，WPM培養基的愈傷組織誘導率最高。如本試驗中選用的WPM培養基適合絨毛白蠟愈傷組織誘導和外植體生長，而MS培養基則表現出高鹽的毒害作用。郭靜等[16]發現WPM是適合植物組織培養的一種培養基，這與本試驗研究一致。

其次，生長調節劑的種類和濃度也對愈傷組織胚性化有影響[17-19]。分裂素有利于愈傷組織胚性化，因此在誘導愈傷組織胚性化時，一般會使用細胞分裂素。本試驗采用BA和KT這兩種分裂素來誘導愈傷組織胚性化的發生。本試驗中除了使用分裂素，還用到了2，4-D，一般說來，2，4-D會抑制愈傷組織胚性化，因為這種激素會抑制細胞分化，然而胚性化就是一種非常復雜的分化過程，如果沒有2，4-D，愈傷組織首先會組織化，轉變為一些成熟組織，如導管和木質部，因此為了抑制愈傷組織的分化，必須要使用2，4-D;為了獲得胚性化的愈傷組織，就必須選擇適宜的分裂素與2，4-D的比例，從本試驗結果可以看出，較高的分裂素與2，4-D的比值會促進愈傷組織胚性化。在愈傷組織誘導的研究中，2，4-D濃度變為1 mol·L-1時，會出現褐變、對外植體產生毒害現象;GA3濃度變為1 mol·L-1時，也會對外植體產生嚴重的毒害現象。所以，選擇適宜的生長調節劑濃度對胚性愈傷組織誘導很重要。

松散型胚性愈傷組織中處于胚性階段的細胞顯著多于緊密型愈傷組織;而且松散型胚性愈傷組織結構松散，使其每個細胞具有高度的同一性[20]，可以提高遺傳和轉化效率，還易于再生;采用松散型胚性愈傷組織作為誘變材料可以獲得更高的誘變率;采用松散型胚性愈傷組織相比普通胚性愈傷組織簡化了脫毒步驟，節省了時間，提高了效率。

繼代培養中不同培養基配比也起到了重要的作用。其中最適宜繼代培養的培養基配方：2.0 mg·L-1 6，BA+0.1 mg·L-1 NAA。在繼代培養中，部分愈傷組織出現褐化現象。相關研究表明，褐變主要由苯酚氧化形成，在多酚氧化酶作用下形成喹諾酮。褐變現象的出現與消毒劑和消毒時間、培養基組成和環境密切相關[21]。在后續試驗中，可以去研究如何抑制在繼代培養中愈傷組織褐化[22]。

由于本試驗只研究到了誘導胚性愈傷組織，為絨毛白蠟的無性快速繁殖、體細胞誘變與遺傳轉化奠定基礎，尚未對絨毛白蠟的再生進行討論研究。因而，關于絨毛白蠟胚性愈傷組織的體細胞胚發生，有待進一步研究。

通過以上試驗，筆者基本建立了絨毛白蠟胚性愈傷組織誘導的一般方法，現將具體試驗步驟總結如下：先選擇生長良好的絨毛白蠟組培苗，剪取細嫩的莖段，莖段不要木質化;將處理好的莖段外植體接種到WPM+0.5 mg·L-1 2，4-D+5 mg·L-1 GA3+30 g·L-1蔗糖的培養基上，在采用連續光照，光照強度為1 000 lx，培養溫度為24 ℃的條件下進行愈傷組織初步誘導;經過大約40 d的誘導，就可以獲得生長良好的絨毛白蠟愈傷組織，將愈傷組織團切成直徑0.25 cm3大小的小塊，接種到MS+0.5 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 KT+30 g·L-1蔗糖的培養基上，在采用連續光照，光照強度為1 000 lx，培養溫度為22 ℃的條件下進行胚性愈傷組織誘導;經過3次繼代培養，每次繼代時間為10 d，并結合顯微鏡檢，就可以獲得理想的絨毛白蠟胚性愈傷組織。本試驗結果可以為絨毛白蠟組織培養和遺傳育種研究提供參考。該試驗以絨毛白蠟莖段為外植體成功誘導出絨毛白蠟胚性愈傷組織，為之后的體胚誘導奠定了基礎，為絨毛白蠟大規模無性繁殖和遺傳轉化提供了基礎。

參考文獻：

[1] 王因花， 燕麗萍， 孔雨光， 等. 絨毛白蠟組培快繁研究[J]. 中國農學通報， 2019， 35（14）： 41-46.

[2] 王磊， 李淑娟， 徐云剛， 等. 絨毛白蠟成熟胚和莖段培養繁殖體系的建立[J]. 林業科技， 2008， 33（3）： 1-3.

[3] 陳紅. 植物組織培養技術的現狀及發展趨勢[J]. 生物化工， 2018， 4（5）： 137-139.

[4] 許丁帆， 劉艷軍， 陶則滿， 等. 絲棉木松散型胚性愈傷組織的誘導與增殖[J]. 西部林業科學， 2021， 50（4）： 74-79.

[5] PREECE J E， BATES S. In vitro studies with white ash （Fraxinus americana） nodules[M]//AHUJA M R. Woody Plant Biotechnology. New York： Plenum Press， 1991： 37-44.

[6] 張麗杰， 趙麗蒙， 陸秀君， 等. 水曲柳子葉和下胚軸愈傷組織和體胚的誘導[J]. 分子植物育種， 2015， 13（7）： 1645-1652.

[7] 孔冬梅. 水曲柳體細胞胚胎發生及體細胞胚與合子胚的發育[D]. 哈爾濱： 東北林業大學， 2004.

[8] 董社琴， 李冰雯. 對節白蠟愈傷組織誘導的研究[J]. 安徽農業科學， 2008， 36（26）： 11228-11229.

[9] 王彩云， 白吉剛， 楊玉萍. 對節白蠟的組織培養及植株再生[J]. 植物生理學通訊， 1999， 35（4）： 299-300.

[10] 葉景豐， 馬冬菁， 陳罡， 等. 美國白蠟組培快繁技術研究[J]. 林業實用技術， 2010（11）： 30-31.

[11] 咸洋， 韓彪， 穆艷娟， 等. 絨毛白蠟組織培養研究[J]. 安徽農學通報， 2020， 26（8）： 16-17， 32.

[12] 陳之群， 劉志敏. 絨毛白蠟莖段的組織培養及植株再生[J]. 安徽農業科學， 2006， 34（3）： 472-473.

[13] 寧苓. 絨毛白蠟組培快繁技術研究[J]. 遼寧林業科技， 2018（4）： 36-37.

[14] 許丁帆， 劉艷軍， 王趙囡， 等. 絨毛白蠟組培快繁體系的建立[J]. 北方園藝， 2021（19）： 78-83.

[15] 燕麗萍， 李麗， 劉翠蘭， 等. 絨毛白蠟體胚誘導和植株再生[J]. 植物學報， 2016， 51（6）： 807-816.

[16] 郭靜， 柴慈江， 史燕山， 等. 蘋果砧木G.11試管苗增殖與生根培養研究[J]. 天津農學院學報， 2019， 26（4）： 38-42， 48.

[17] 孔祥生， 張妙霞， 陳明燦. 生長素類物質對甘薯莖尖分生組織培養成苗的影響[J]. 山地農業生物學報， 2003， 22（2）： 114-116.

[18] 周索， 李景照. 不同類型生長素及濃度對翠菊葉片愈傷組織誘導的影響[J]. 鄭州師范教育， 2012， 1（4）： 52-53.

[19] 李琴， 江千濤， 魏育明， 等. 生長素對小麥幼胚組織培養的影響[J]. 西南農業學報， 2006， 19（5）： 806-810.

[20] 苗博瑛， 劉艷軍， 楊靜慧. 黑莓松散型胚性愈傷組織的誘導[J]. 山西農業科學， 2014， 42（3）： 209-212， 216.

[21] 呂國昊， 趙杰堂. 植物組織培養中褐化現象的控制措施[J]. 農村經濟與科技， 2021， 32（13）： 50-52.

[22] 亓崢， 龐志強， 藍增全. 云南小葉種茶樹葉片和莖段愈傷組織誘導及繼代培養[J]. 科學技術與工程， 2020， 20（18）： 7206-7212.