基于系統藥理學研究水飛薊治療肺癌的作用機制

張玉如，田旭萍，肖 偉，王永華*

? 藥理與臨床?

基于系統藥理學研究水飛薊治療肺癌的作用機制

張玉如1，田旭萍1，肖 偉2*，王永華1*

1. 石河子大學 新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆 石河子 832002 2. 江蘇康緣藥業有限公司，江蘇 連云港 222000

研究水飛薊對肺癌的作用及其機制。利用中藥系統藥理學數據庫（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）篩選水飛薊的活性成分，并利用加權整體相似度法（weighted ensemble similarity，WES）和系統藥物靶向工具（systematic drug targeting，SysDT）模型預測候選活性成分的靶點；進行基因本體論生物學過程（gene ontology biological process，GO BP）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析揭示靶點所涉及BP以及通路。選取水飛薊主要活性成分水飛薊賓進行體內外實驗驗證，首先驗證水飛薊賓對人肺腺癌H1975細胞與小鼠肺癌LLC細胞的體外抑制率；其次用流式細胞術評估水飛薊賓對腫瘤細胞系的促凋亡作用；隨后在LLC肺癌動物模型進行體內抑瘤驗證，并檢測瘤內細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T cell，CD8+T）的浸潤量；最后通過Western blotting法檢測凋亡相關蛋白表達。經過篩選得到12個活性成分與355個靶點，并構建了活性成分-靶點網絡。CCK-8檢測結果顯示水飛薊賓能夠抑制肺癌細胞的增殖，且呈劑量相關性；體內外流式實驗表明水飛薊賓能通過促進瘤內CD8+T細胞的浸潤從而促進癌細胞的凋亡來發揮抗腫瘤作用；水飛薊賓能夠上調腫瘤細胞和腫瘤組織p53蛋白表達水平（＜0.001），下調B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）蛋白表達水平（＜0.05、0.001）。水飛薊主要通過調控凋亡相關通路發揮抗腫瘤作用。

水飛薊；水飛薊賓；肺癌；系統藥理學；凋亡；CD8+T細胞

惡性腫瘤屬于世界性高發性疾病，不僅影響了人們的生活質量，甚至導致患者的直接死亡。在我國，隨著人們的不良生活習慣增加，癌癥的發病率和死亡率逐年攀升，并且已經逐步成為我國致死率最高的疾病之一。眾多癌癥中“肺癌”是目前世界公認的“癌中之王”[1]。據統計，2020年肺癌仍然是最常見的癌癥，全年新增病例82萬例，占新增人口的17.9%[2]，全球因肺癌死亡人數為72萬人，占全球死亡人數18.1%[3]，仍是國內致死率最高的癌癥。確診患者中85%的肺癌患者被確診為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），并且超過半數的患者被確診時已經處于中晚期，存活率普遍偏低[4]。目前臨床常用的治療方式包括手術、放療、化療以及靶向治療等[5]，這些治療方式有一定的臨床療效，但在消滅癌細胞的同時也會對患者的機體造成很大的傷害，如5%～20%的肺癌患者接受放療后出現肺損傷的情況，包括急性炎癥（放療后1～3個月）和慢性纖維化（放療后6～24個月）[6]；而化療有廣泛的細胞毒性，將會導致部分免疫細胞功能障礙等不良反應[7]，這些不良反應會導致耐受力差的患者喪失性命，此外，高昂的治療費用也會給患者家庭帶來巨大的經濟負擔。因此，在治療肺癌的研究中，需要探尋新的突破點。

水飛薊(L.) Gaertn.屬菊科，是1年生或2年生草本植物，具有2000多年的用藥歷史[8]，其藥用部位為成熟的果實，主要化學成分為黃酮類化合物及延胡索酸，是一種優良的護肝植物。除護肝作用外，水飛薊還具有很強的抗氧化作用，并且能夠調節多條信號通路從而抑制炎性介質產生[9]。水飛薊素是從水飛薊的種子中提取出的一種黃酮木質素類混合物，包括水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊寧等活性成分[10]，水飛薊賓在水飛薊提取物中含量最高，約占60%～70%[11]，為水飛薊的主要活性成分。研究表明，水飛薊賓具有抗炎、抗氧化、抗纖維化等藥理作用[12-13]。除此之外，水飛薊賓能夠通過降低表皮鳥氨酸脫羧酶的表達從而抑制腫瘤的生長[14]，因此，水飛薊除了保肝作用外還有潛在的抗腫瘤作用[15]。

隨著中醫藥的發展，中藥被廣泛用于治療各種疾病，但由于中藥具有多種活性成分以及多個作用靶點，并且不同活性成分與靶點間可能存在不同的對應關系，需要研究者深入探究。為了明確中藥活性成分與靶點間的作用關系，一門通過計算機技術輔助的多學科結合的新興技術——系統藥理學[16]應運而生。該技術通過中藥系統藥理學分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）將吸收、分布、代謝和排泄（absorption，distribution，metabolism and excretion，ADME）建模技術、靶點預測及通路/網絡分析進行整合，以闡明中藥復雜成分與治療靶點及通路之間的關系[17]。本研究首先通過系統藥理學方法，從多靶點、多層次揭示水飛薊潛在的抗腫瘤作用機制，其次通過體內及體外實驗驗證水飛薊是否通過增加腫瘤微環境中細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T cell，CD8+T）的浸潤量而促進腫瘤細胞凋亡，從而發揮抗腫瘤作用，為水飛薊發揮抗腫瘤作用提供理論基礎，同時也為臨床抗腫瘤研究提供新思路。

1 材料

1.1 細胞

人非小細胞肺癌細胞系H1975與小鼠肺癌細胞LLC購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 動物

SPF級雌性C57BL/6小鼠20只，體質量18～22 g，5～6周齡，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，合格證號NO.110324211102407337。動物于溫度（25±1）℃、濕度（55±5）%的SPF級環境中，12 h光照/黑暗周期，適應性飼養1周。動物實驗經北京大學實驗動物福利倫理委員會批準（批準號2021051101）。

1.3 藥品與試劑

水飛薊賓（質量分數為98%，批號M17GB148678）、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu，質量分數為98%，批號C27N11Y131954）、分散酶II（批號D20J11H118950）、透明質酸酶（批號W11M11H109348）購自上海源葉生物有限公司；二甲基亞砜（批號161031768F）購自美國Sigma公司；DMEM培養基（批號8121510）、RPMI 1640培養基（批號8121327）、胎牛血清購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒（批號B1320111）購自上海貝博公司；Qproteome?Q哺乳動物蛋白提取試劑盒（批號169011710）購自德國Qiagen公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號082820201207）、DNA酶I（批號D7073-1）、RIPA強裂解液（批號P0013B）、紅細胞裂解液（批號C3702）購自江蘇碧云天公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒（批號0027279）購自美國BD Pharmingen公司；Immun-Star TM WesternC TM化學發光試劑盒（批號102031555）購自美國Bio-Rad公司；膠原酶IV（批號2049898）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；抗小鼠CD16/32 mAb抗體（批號20U092008212）、CD45-PE-Cy7抗體（批號B328900）、CD3e-APC抗體（批號25G091905112）、CD8a-PE抗體（批號13326019）購自美國BioLegend公司；p53抗體（批號00098490）購自美國Proteintech公司；B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抗體（批號GR3217999-13d）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號GR217575-65）、HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（批號GR231489-7）購自美國Abcam公司。

1.4 儀器

3131型細胞培養箱、Invitrogen全自動細胞計數儀（美國賽默飛世爾科技公司）；primo vert倒置顯微鏡（德國蔡司公司）；TDZ4-WS型臺式低速離心機（中佳科技有限公司）；5418型小型高速離心機、高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；AUW120D型電子天平（日本島津公司）；組織勻漿機（上海達洛科學儀器有限公司）；Flexstation 3多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）；3208025型酶標板振蕩器（德國IKA公司）；垂直電泳系統、蛋白質小型轉印槽、多功能凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad公司）；NovoCyte 3130型流式細胞儀（ACEA Biosciences公司）；柜式冰箱（海爾股份有限公司）；超純水儀（默克密理博公司）。

2 方法

2.1 系統藥理學

2.1.1 水飛薊分子數據庫的建立以及靶點預測 首先以“水飛薊”“有效成分”等為主題詞進行文獻檢索，通過TCMSP數據庫收集水飛薊的化學成分并構建分子集合，然后，根據本實驗室構建的ADME系統計算候選分子的藥動學參數，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）[18]≥30%以及類藥性（drug-likeness，DL）[19]≥0.18作為閾值，篩選水飛薊的潛在候選活性成分。

本研究采用的是本實驗室自主研發的靶點預測工具：加權系綜相似度模型[20]（weighted ensemble similarity，WES）和系統藥物靶向工具（systematic drug targeting，SysDT）[21]來預測水飛薊活性成分的直接與間接靶點用于后續分析。

2.1.2 基因本體論生物學過程（gene ontology biological process，GO BP）富集分析 為了進一步研究水飛薊的活性成分的潛在作用機制，利用DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）[22]對活性成分的靶點進行GO BP與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，以＜0.01為篩選標準。

2.1.3 網絡構建與分析 為了研究活性成分-靶點的相互作用關系以及靶點的功能對潛在的生物通路的調控作用，分別將篩選出的活性成分與靶點或靶點與通路導入Cytoscape 3.7.1軟件[23]并構建活性成分-靶點、靶點-通路網絡，同時對網絡圖進行網絡拓撲參數分析，在網絡圖中，活性成分、靶點、通路由節點表示，2個節點間相互作用由邊表示，相連的邊越多則表明該節點在網絡中越重要。

2.2 水飛薊抗腫瘤實驗驗證

水飛薊賓作為《中國藥典》2020年版中水飛薊的指標成分，也是水飛薊的主要活性成分。因此，本研究選取水飛薊賓進行后續的實驗驗證，來評估系統藥理學預測的可靠性與準確性。

2.2.1 細胞培養 H1975細胞和LLC細胞分別用10%胎牛血清的RPMI 1640和DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。

2.2.2 細胞增殖檢測 將處于對數生長期的H1975和LLC細胞以1×104個/孔接種于96孔板中，培養24 h，然后加入不同濃度（5、10、20、50、80、100、150、200 μmol/L）的水飛薊賓培養48 h，對照組加入不含藥物的培養基，空白組不接種細胞；加入CCK-8試劑，避光孵育1～4 h，采用酶標儀測定450 nm處的吸光度（）值，計算藥物對細胞的抑制率。

細胞抑制率＝(對照－給藥)/(對照－空白)

2.2.3 流式細胞術分析水飛薊賓對H1975細胞的凋亡作用 將處于對數生長期的H1975細胞以5×105個/孔接種于6孔板，加入不同濃度（20、50、100 μmol/L）的水飛薊賓處理24 h，對照組加入不含藥物的培養基，收集細胞，使其重懸在100 μL的結合緩沖液中，加入5 μL FITC標記的Annexin V和PI，冰上避光孵育10 min，上機檢測，使用FlowjoV10軟件分析細胞凋亡率。

2.2.4 Western blotting檢測水飛薊賓對H1975細胞p53和Bcl-2蛋白表達的影響 將H1975細胞以1×106接種于60 mm培養皿中，待其貼壁后，加入不同濃度（20、50、100 μmol/L）水飛薊賓處理24 h，對照組加入不含藥物的培養基，收集細胞，加入裂解液裂解15 min，13 800 r/min離心15 min，取上清；按BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，95 ℃加熱10 min使蛋白變性。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中室溫封閉2～3 h；分別加入p53、Bcl-2和GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜；加入HRP標記的山羊抗兔IgG抗體，室溫孵育1.0～1.5 h；使用化學發光試劑盒對信號進行可視化，并用ChemiDoc? XRS+成像系統進行條帶分析。

2.2.5 動物抑瘤實驗 將LLC細胞重懸于PBS中，并以5×105個接種于小鼠左上肢腋下皮下（第0天），將小鼠隨機分為對照組、5-Fu（15 mg/kg）組和水飛薊賓（5 mg/kg）組，每組6只。接種后第3天開始給藥，對照組ip生理鹽水，5-Fu組和水飛薊賓組ig相應藥物，當腫瘤達到5 mm時，每2天測量1次腫瘤體積，當腫瘤直徑大于20 mm時判定小鼠死亡，接種后第20天對小鼠進行取材，稱定質量，記錄數據用于后續分析。

腫瘤體積＝長×寬2×0.5

2.2.6 流式細胞術檢測小鼠腫瘤組織中CD8+T細胞 取各組小鼠腫瘤組織，剪碎至泥狀置于皿中，每個皿中加入2～3 mL消化液（1 mL HBSS緩沖液中含有1 μL的DNA酶I、20 μL的10%膠原酶IV、5 μL的10%透明質酸酶和10 μL的5%分散酶），于37 ℃消化30 min，每10分鐘搖晃混勻1次，用4～6 mL培養基終止消化，過70 μm濾網并研磨組織，離心。加入5～8 mL紅細胞裂解液裂解5～10 min，加入30 mL PBS終止裂解，過40 μm濾網，離心后清洗1～2遍至無血色，重懸并計數，使100 μL細胞懸液中含有1×106個細胞，加入1 μL抗小鼠CD16/32抗體，冰上孵育10 min，用PBS洗2遍，用100 μL的PBS重懸，用CD45-PE-Cy7、CD3e-APC、CD8a-PE抗體標記，室溫孵育30 min，用PBS洗3遍后，用500 μL PBS重懸，上機檢測。

2.2.7 Western blotting檢測水飛薊賓對荷瘤小鼠腫瘤組織p53和Bcl-2蛋白表達的影響 取各組小鼠腫瘤組織200～300 mg，加入磁珠與1 mL PBS進行組織勻漿，1500 r/min離心5 min，棄上清，加入紅細胞裂解液勻漿，于冰上裂解10～15 min，離心后棄上清，用PBS洗滌至無血色并盡量去除上清，加入RIPA強裂解液-磷酸酶抑制劑-蛋白酶抑制劑（100∶10∶1），冰上震蕩15 min，13 800 r/min離心15 min，取上清；按“2.2.4”項下方法制備蛋白樣品，并進行Western blotting分析。

2.3 統計方法

采用Prism 8.0軟件進行統計，所有數據均采用檢驗或方差分析（ANOVA）進行統計分析。

3 結果

3.1 系統藥理學

3.1.1 水飛薊分子庫的構建及有效成分的篩選及活性成分-靶點網絡的構建 首先，通過TCMSP數據庫篩選出水飛薊活性成分34個，根據ADME進行篩選，以OB≥30%以及DL≥0.18作為篩選條件，從34個活性成分中篩選得到11個潛在的活性成分；為了使結果更加全面，同時也能彌補理論篩選的不足，將藥動學特性低但具有經典藥理活性且含量較高的水飛薊賓保留下來作為有效成分[24]。最后，12個成分作為有效活性成分集合（表1）。研究發現，二氫槲皮素（MOL5，OB＝60.5%，DL＝0.27）又稱紫杉葉素，可以通過OCT4基因抑制肺癌干細胞的增殖與上皮間質轉化[25]。槲皮素（MOL1，OB＝46.4%，DL＝0.28）在120 μmol/L時，能夠明顯促進人急性淋巴母細胞白血病細胞（MOLT-4）、淋巴瘤細胞（Raji）、小鼠結腸癌細胞（CT-26）、人前列腺癌細胞（LNCaP）等癌細胞的凋亡[26]。在前列腺癌中，水飛薊寧（MOL9，OB＝59.7%，DL＝0.76）在60 μmol/L時能夠促使前列腺癌細胞阻滯于G1期，即水飛薊寧能夠通過對癌細胞進行周期阻滯從而發揮抗腫瘤作用[27]。上述研究結果均表明水飛薊具有抑制腫瘤生長、促進腫瘤細胞凋亡的作用，并且為系統藥理學方法預測的有效性和合理性提供了數據支撐。

表1 水飛薊活性成分

Table 1 Active ingredients of S. marianum

MOL ID活性成分類別OB/%DL MOL1槲皮素黃酮類46.40.28 MOL2豆甾醇甾醇類43.80.76 MOL3膽固醇甾醇類37.90.68 MOL4花生四烯酸不飽和脂肪酸類45.60.20 MOL5二氫槲皮素黃酮類60.50.27 MOL6生育酚脂溶性維生素32.30.69 MOL7禾本甾醇甾醇類44.20.75 MOL8水飛薊賓黃酮類木質素0.90.93 MOL9水飛薊寧黃酮類木質素59.70.76 MOL10水飛薊素黃酮類木質素81.80.80 MOL11水飛薊蘭君黃酮類木質素64.10.94 MOL12異水飛薊素黃酮類木質素30.30.40

接著通過WES和SysDT模型的計算共獲得12個成分的941個靶點，將這些靶點映射至比較毒物基因組學數據庫（comparative toxicogenomics database，CTD）數據庫中，篩選出474個相關靶點，其中355個與癌癥相關的靶點。為了使結果更加一目了然，構建了可視化的活性成分-靶點網絡（圖1）來進一步揭示活性化合物的靶點協同治療作用。從圖中可以發現許多靶點是臨床上用于癌癥檢測與診斷的指標。例如，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在食管癌、乳腺癌等不同形式的癌癥中高表達，并且其表達與癌癥的不良預后呈正相關[28]。TP53作為抑癌基因，在正常細胞中低表達，而在惡性腫瘤中高表達，受多種應激源刺激而激活，從而調控細胞的增殖和衰老、DNA損傷修復及細胞死亡基因的表達[29]。除了上述2個癌癥相關靶點，水飛薊活性成分的很多靶點也是其他腫瘤相關的靶基因。因此，通過預測靶點分析，可以發現水飛薊具有潛在的抗腫瘤作用。

3.1.2 GO BP富集分析 BP分析可以揭示候選靶點與生物學功能之間的關系，進一步分析靶點間潛在的互作關系。因此，為了探究水飛薊靶點與肺癌之間的關聯性，將所得的候選靶點映射到DAVID數據庫中進行了GO富集分析（＜0.01）。從圖2可以看到，獲得了14個與癌癥密切相關的BP，其中凋亡過程、正向調節凋亡過程以及細胞增殖的負向調控等過程得到顯著富集；而負向調節細胞增殖與正向調節凋亡表明該藥物在抑制癌細胞增殖的同時也能夠促進腫瘤細胞的凋亡，2個生物學過程形成了良好的協同作用。通過活性成分靶點的GO分析，發現水飛薊可能是通過參與調控腫瘤細胞的凋亡過程從而發揮抗腫瘤作用。

圖1 活性成分-靶點網絡

圖2 靶點的GO BP富集分析

3.1.3 靶點-通路網絡 為了探尋靶點和肺癌治療相關通路間的互作關系，對水飛薊的靶點進行了KEGG通路富集分析，將其關鍵靶點映射到KEGG數據庫中，篩選出13條相關通路，并構建了可視化的靶點-通路網絡（圖3），通路包括癌癥相關通路、非小細胞肺癌相關通路、小細胞肺癌通路、病毒致癌性相關通路、癌癥中轉錄調節相關通路、凋亡相關通路、p53信號通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路等。富集結果再次表明水飛薊具有潛在的抗腫瘤作用，并且從圖中可以看到，p53、Bcl-2、EGFR、生長因子受體結合蛋白2（growth factor receptor bound protein 2，GRB2）等絕大多數靶點處于非小細胞肺癌的通路中，其可能是治療肺癌的關鍵靶點。上述靶點所映射到的通路有p53信號通路、凋亡通路、缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信號通路等，這些通路可能是水飛薊發揮抗腫瘤作用的關鍵通路。推測水飛薊可能通過影響細胞的凋亡通路，從而達到抗腫瘤作用。目前已有研究指出，姜黃素[30]、木犀草素[31]、川楝素[32]等能夠通過介導p53的變化誘導腫瘤細胞凋亡，從而發揮抗腫瘤作用。Bcl-2家族蛋白在腫瘤細胞凋亡和腫瘤形成中發揮重要作用[33]，作為重要的凋亡調控因子，主要通過控制線粒體的完整性調控凋亡，并且在包括肺癌的多種癌癥中高表達[34]。因此，推測水飛薊可能是通過調節p53和Bcl-2的表達促進癌細胞的凋亡，從而發揮抗腫瘤作用。

圖3 靶點-通路網絡圖

3.2 實驗驗證

3.2.1 水飛薊賓對H1975和LLC細胞存活率的影響 如圖4所示，水飛薊賓對H1975和LLC細胞的抑制作用均呈劑量相關性，即水飛薊賓在體外能抑制腫瘤細胞的增殖，從而發揮抗腫瘤作用，水飛薊賓對H1975細胞的半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值為62.58 μmol/L，對LLC細胞的IC50值為61.44 μmol/L。

圖4 水飛薊賓對H1975細胞 (A) 和LLC細胞(B) 存活率的影響

3.2.2 凋亡模塊驗證 凋亡又名細胞程序性死亡，是細胞正常發育、應激和形態改變過程中調控死亡的主要途徑[35]。該途徑不僅可以清除體內多余的細胞，也能及時發現突變細胞防止其進一步癌變，進而確保機體內細胞數量的平衡與質量的穩定[36]。細胞凋亡也是癌癥治療的關鍵過程，受許多基因如抑癌基因p53、抗凋亡基因Bcl-2的調控[37]。故推測水飛薊賓可能是通過促進癌細胞的凋亡從而發揮抗腫瘤作用。結合前期系統藥理學靶點預測與富集分析結果，發現Bcl-2、p53等靶點以及凋亡過程、凋亡通路等凋亡相關的靶點、BP及通路得到了顯著富集。因此，為了探究水飛薊賓是否促進腫瘤細胞發生凋亡，采用Annexin V/PI雙染對H1975細胞進行流式細胞術分析（圖5-A），對照組細胞凋亡率為0，20、50、100 μmol/L的水飛薊賓組細胞凋亡率分別為4.24%、10.2%和25.4%，表明水飛薊賓能夠促進腫瘤細胞的凋亡，且呈劑量相關性。如圖5-B所示，與對照組比較，各給藥組細胞p53蛋白表達水平顯著升高（＜0.001），Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.001），表明水飛薊賓能夠通過調控p53和Bcl-2的表達進而誘導腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞的生長和轉移，與前期預測結果一致，也表明系統網絡藥理學預測的準確性與可靠性。

與對照組比較：*P＜0.05 ***P＜0.001，下圖同

3.2.3 水飛薊體內抗腫瘤作用 研究顯示，CD8+T細胞在抗腫瘤免疫中發揮極大的作用，當T細胞被激活后，能夠識別位于I類組織相容性復合體上的腫瘤相關抗原[38]，主要通過2種方式誘導癌細胞凋亡：一種是通過分泌一些細胞因子（如穿孔素和顆粒酶）而促進癌細胞凋亡；另一種則通過死亡配體（如Fas配體或TNF相關凋亡配體）與死亡受體的結合而誘導癌細胞凋亡[39]。另外有研究表明，腫瘤內CD8+T細胞的浸潤量與患者預后有著密不可分的關系，浸潤量越高，預后效果越好[40]。為了探究水飛薊賓的體內抗腫瘤作用，使用C57BL/6小鼠進行了LLC異種移植實驗，給藥20 d后，腫瘤體積（圖6-A）和腫瘤質量（圖6-B）顯著降低，表明水飛薊賓具有明顯的抗腫瘤作用。如圖6-C所示，與對照組比較，各給藥組腫瘤組織p53和Bcl-2蛋白表達變化與體外實驗中變化趨勢一致。如圖6-D所示，水飛薊賓組腫瘤內CD8+T細胞的浸潤量（9.78%）高于對照組腫瘤內CD8+T細胞的浸潤量（5.27%）。綜上所述，水飛薊賓能夠通過增加腫瘤內CD8+T細胞的浸潤量從而促進癌細胞的凋亡而發揮抗腫瘤作用。

圖6 水飛薊素對荷瘤小鼠腫瘤體積 (A)、腫瘤質量 (B) 以及腫瘤組織p53、Bcl-2蛋白表達(C) 和CD8+ T細胞含量(D) 的影響(, n = 2)

4 討論

近年來，肺癌已逐漸變成全球癌癥相關死亡的最常見原因，占全球所有癌癥死亡人數的18.4%[41]。由于癌癥的復雜性及難治性，使得中藥在發揮抗腫瘤作用的方面受到了廣泛的關注與研究，高效低毒的特性使之極具研究與開發的潛力。

本研究通過建立水飛薊活性成分-靶點、靶點相應的生物功能和通路網絡探討水飛薊治療肺癌的作用機制。首先，利用TCMSP數據庫構建了含有34個活性成分的水飛薊分子數據庫，從數據庫中通過OB、DL 2個參數進一步篩選得到12個活性成分，并構建了活性成分-靶點網絡圖；接著通過WES與SysDT模型預測得到12個活性成分與癌癥相關的355個靶點，并通過GO BP與KEGG通路富集分析得到14個BP條目與13條相關通路，其中正向調控凋亡過程、p53信號通路、凋亡通路、Ｔ細胞受體信號通路說明水飛薊可能是通過激活CD8+T細胞并促進癌細胞凋亡而發揮抗腫瘤作用。研究表明，CD8+T細胞抗腫瘤的主要作用機制是通過穿孔素/顆粒酶介導的死亡受體結合的殺傷和誘導癌細胞凋亡[42]。

整合實驗結果發現，在體外實驗中，水飛薊賓能夠抑制肺癌細胞H1975與LLC的增殖作用，并且能夠促進腫瘤細胞的凋亡作用，同時也能夠上調抑癌基因p53的表達，并且抑制Bcl-2的表達而發揮抗腫瘤作用。在體內實驗中，水飛薊賓能增加荷瘤小鼠腫瘤內CD8+T細胞浸潤量，并且腫瘤組織p53與Bcl-2表達的變化與細胞水平一致，這表明水飛薊賓是通過激活T細胞并促進腫瘤細胞的凋亡進而達到抗腫瘤作用[1]。

綜上所述，本研究提供了一種基于系統藥理學從分子、網絡、通路等層面的來分析水飛薊治療肺癌的新方法，也解析了中藥的多成分、多靶點、多通路協同治療肺癌的機制，并進行了數據可視化分析，使得中藥的復雜成分變得更加清晰明了。本研究表明水飛薊賓主要通過促進癌細胞的凋亡而發揮抗腫瘤作用，證實了通過系統藥理學所分析的相關靶點與通路的可靠性，并為深入探討其作用機制奠定了堅實的理論基礎，故今后可從凋亡途徑入手，去探尋新的抗腫瘤藥物或靶點從而更好地協助臨床治療。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Schabath M B, Cote M L. Cancer progress and priorities: Lung cancer [J]., 2019, 28(10): 1563-1579.

[2] Cao W, Chen H D, Yu Y W,. Changing profiles of cancer burden worldwide and in China: A secondary analysis of the global cancer statistics 2020 [J]., 2021, 134(7): 783-791.

[3] Dela Cruz C S, Tanoue L T, Matthay R A. Lung cancer: Epidemiology, etiology, and prevention [J]., 2011, 32(4): 605-644.

[4] Goodspeed A, Jean A, Costello J C. A whole-genome CRISPR screen identifies a role of MSH2in cisplatin-mediated cell death in muscle-invasive bladder cancer [J]., 2019, 75(2): 242-250.

[5] Arbour K C, Riely G J. Systemic therapy for locally advanced and metastatic non-small cell lung cancer: A review [J]., 2019, 322(8): 764-774.

[6] Deng G D, Liang N, Xie J,. Pulmonary toxicity generated from radiotherapeutic treatment of thoracic malignancies [J]., 2017, 14(1): 501-511.

[7] Martínez-López J, Mateos M V, Encinas C,. Multiple myeloma and SARS-CoV-2 infection: Clinical characteristics and prognostic factors of inpatient mortality [J]., 2020, 10(10): 103.

[8] Abenavoli L, Izzo A A, Mili? N,. Milk thistle (): A concise overview on its chemistry, pharmacological, and nutraceutical uses in liver diseases [J]., 2018, 32(11): 2202-2213.

[9] Federico A, Dallio M, Loguercio C. Silymarin/silybin and chronic liver disease: A marriage of many years [J]., 2017, 22(2): 191.

[10] Kroll D J, Shaw H S, Oberlies N H. Milk thistle nomenclature: Why it matters in cancer research and pharmacokinetic studies [J]., 2007, 6(2): 110-119.

[11] Yang G, Zhao Y P, Zhang Y T,. Enhanced oral bioavailability of silymarin using liposomes containing a bile salt: Preparation by supercritical fluid technology and evaluationand[J]., 2015, 10: 6633-6644.

[12] Esselun C, Bruns B, Hagl S,. Differential effects of silibinin A on mitochondrial function in neuronal PC12 and HepG2 liver cells [J]., 2019, 2019: 1652609.

[13] 張志鵬, 孟艷秋, 王趲. 水飛薊賓及其衍生物生物活性及作用機制的研究進展[J]. 中草藥, 2021, 52(12): 3717-3724.

[14] Prasad R R, Paudel S, Raina K,. Silibinin and non-melanoma skin cancers [J]., 2020, 10(3): 236-244.

[15] Bijak M. Flavonolignans-compounds not only for liver treatment [J]., 2017, 42(247): 34-37.

[16] Zheng C L, Guo Z H, Huang C,. Large-scale direct targeting for drug repositioning and discovery [J]., 2015, 5: 11970.

[17] Ru J L, Li P, Wang J N,. TCMSP: A database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines [J]., 2014, 6: 13.

[18] 黃超. 藥物口服生物利用度預測及在中藥歸經研究上的應用 [D]. 咸陽: 西北農林科技大學, 2015.

[19] 田盛, 李有勇, 侯廷軍. 中草藥化合物類藥性的理論研究[A] // 中國化學會第28屆學術年會第14分會場摘要集[C]. 成都: 中國化學會, 2012: 27.

[20] 鄭春麗. 基于靶點網絡的中藥復方協同整合作用機制研究 [D]. 咸陽: 西北農林科技大學, 2017.

[21] Yu H, Chen J X, Xu X,. A systematic prediction of multiple drug-target interactions from chemical, genomic, and pharmacological data [J]., 2012, 7(5): e37608.

[22] Huang D W, Sherman B T, Tan Q N,. DAVID bioinformatics resources: Expanded annotation database and novel algorithms to better extract biology from large gene lists [J]., 2007, 35: W169-W175.

[23] Lopes C T, Franz M, Kazi F,. Cytoscape Web: An interactive web-based network browser [J]., 2010, 26(18): 2347-2348.

[24] Bijak M. Silybin, a major bioactive component of milk thistle (L. Gaernt.)-chemistry, bioavailability, and metabolism [J]., 2017, 22(11): 1942.

[25] Wang R H, Zhu X J, Wang Q,. The anti-tumor effect of taxifolin on lung cancer via suppressing stemness and epithelial-mesenchymal transitionand oncogenesis in nude mice [J]., 2020, 8(9): 590.

[26] Hashemzaei M, Delarami Far A, Yari A,. Anticancer and apoptosis?inducing effects of quercetinand[J]., 2017, 38(2): 819-828.

[27] Deep G, Oberlies N H, Kroll D J,. Identifying the differential effects of silymarin constituents on cell growth and cell cycle regulatory molecules in human prostate cancer cells [J]., 2008, 123(1): 41-50.

[28] Talukdar S, Emdad L, Das S K,. EGFR: An essential receptor tyrosine kinase-regulator of cancer stem cells [J]., 2020, 147: 161-188.

[29] Lacroix M, Riscal R, Arena G,. Metabolic functions of the tumor suppressor p53: Implications in normal physiology, metabolic disorders, and cancer [J]., 2020, 33: 2-22.

[30] He Y C, He L, Khoshaba R,. Curcumin nicotinate selectively induces cancer cell apoptosis and cycle arrest through a P53-mediated mechanism [J], 2019, 24(22): 4179.

[31] Lin Y, Shi R X, Wang X,. Luteolin, a flavonoid with potential for cancer prevention and therapy [J]., 2008, 8(7): 634-646.

[32] Zhang S, Cao L, Wang Z R,. Anti-cancer effect of toosendanin and its underlying mechanisms [J]., 2019, 21(3): 270-283.

[33] Kontos C, Christodoulou M I, Scorilas A. Apoptosis-related BCL2-family members: Key players in chemotherapy [J]., 2014, 14(3): 353-374.

[34] Onel B, Carver M, Wu G H,. A new G-quadruplex with hairpin loop immediately upstream of the human BCL2 P1 promoter modulates transcription [J]., 2016, 138(8): 2563-2570.

[35] Xu X B, Lai Y Y, Hua Z C. Apoptosis and apoptotic body: Disease message and therapeutic target potentials [J]., 2019, 39(1): BSR20180992.

[36] Zehra B, Ahmed A, Sarwar R,. Apoptotic and antimetastatic activities of betulin isolated fromagainst non-small cell lung cancer cells [J]., 2019, 11: 1667-1683.

[37] Koch R, Christie A L, Crombie J L,. Biomarker-driven strategy for MCL1 inhibition in T-cell lymphomas [J]., 2019, 133(6): 566-575.

[38] Fu C M, Jiang A M. Dendritic cells and CD8 T cell immunity in tumor microenvironment [J]., 2018, 9: 3059.

[39] Nguyen A, Ramesh A, Kumar S,. Granzyme B nanoreporter for early monitoring of tumor response to immunotherapy [J]., 2020, 6(40): eabc2777.

[40] Reiser J, Banerjee A. Effector, memory, and dysfunctional CD8(+) T cell fates in the antitumor immune response [J]., 2016, 2016: 8941260.

[41] Si X Y, Wang J W, Cheng Y,. A phase III, randomized, double-blind, controlled trial of carboxyamidotriazole plus chemotherapy for the treatment of advanced non-small cell lung cancer [J]., 2020, 12: 175883592096584.

[42] Costantini A, Julie C, Dumenil C,. Predictive role of plasmatic biomarkers in advanced non-small cell lung cancer treated by nivolumab [J], 2018, 7(8): e1452581.

Mechanisms ofon lung cancer based on system-pharmacology dissection

ZHANG Yu-ru1, TIAN Xu-ping1, XIAO Wei2, WANG Yong-hua1

1. Key Laboratory of Xinjiang Phytomedicine Resource and Utilization, Ministry of Education, Shihezi University, Shihezi 832002, China 2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222000, China

To study the effect and mechanism ofon lung cancer.Candidate active ingredients ofwere screened out by traditional Chinese medicine systems pharmacology (TCMSP), targets were baited through weighted ensemble similarity (WES) and systematic drug targeting (SysDT) models; Gene ontology biological process (GOBP) and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathways of obtained targets were then top enriched. Silybin, the main active compound of, was selected to testandexperiments. Firstly, inhibitory rate of silybin on human lung adenocarcinoma cell (H1975) and mouse lung cancer cell (LLC)was verified; Secondly, apoptosis of silybin was evaluated by flow cytometry; Tumor inhibitionwas validated in non-small cell lung cancer mouse model, infiltration of cytotoxic T cell (CD8+T) cells in tumor was detected; Finally, expressions of apoptosis-related proteins in tumor cells and tissues were verified by Western blotting.Twelve candidate active compounds and 355 targets were obtained, and compound-target network was constructed. The results of CCK-8 showed that silybin inhibited lung cancer cells in a dose-dependent manner, the data of flow cytometryandshowed that silybin could promote the apoptosis of cancer cells by promoting the infiltration of CD8+T cells in tumor cells; Silybin up-regulated p53 protein expression level in tumor cells and tumor tissues (< 0.001), and down-regulated B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) protein expression level (< 0.05, 0.001).mainly exerts anti-tumor effects through regulating apoptosis-related pathways.

(L.) Gaertn.; silybin; lung cancer; systemic pharmacology; apoptosis; CD8+T cells

R285.5

A

0253 - 2670(2022)11 - 3357 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.011

2022-02-15

國家自然科學基金資助項目（U1603285）

張玉如，女，碩士研究生，研究方向為藥理學。E-mail: 641556987@qq.com

王永華，男，博士，教授，博士生導師，研究方向為中西醫結合治療腫瘤的基礎研究。E-mail: dcpwyh@163.com

肖 偉，男，博士，教授，博士生導師，中國工程院院士，研究方向為中藥藥理與臨床。E-mail: xw_kanion@163.com

[責任編輯 李亞楠]