地黃苷D對皮質酮誘導的PC-12細胞損傷的保護作用及機制研究

張 莉，盧仁睿，王慧慧，李 孟，馮衛生, 2*，鄭曉珂, 2*

地黃苷D對皮質酮誘導的PC-12細胞損傷的保護作用及機制研究

張 莉1，盧仁睿1，王慧慧1，李 孟1，馮衛生1, 2*，鄭曉珂1, 2*

1. 河南中醫藥大學藥學院，河南 鄭州 450046 2. 河南省中藥開發工程技術研究中心，河南 鄭州 450046

研究從地黃中分離得到的地黃苷D對皮質酮誘導的腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC-12細胞）的保護作用及機制。以500 μmol/L皮質酮處理PC-12細胞24 h建立損傷模型，同時給予氟西汀和地黃苷D進行干預，采用MTT法檢測細胞存活率；采用流式細胞術檢測細胞凋亡、活性氧（reactive oxygen species，ROS）以及線粒體膜電位水平；采用In-Cell Western法檢測細胞內凋亡相關蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）、剪切型Caspase-3（cleaved Caspase-3）、B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）和Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）表達；采用高內涵細胞成像系統檢測細胞內腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）蛋白表達。地黃苷D明顯提高皮質酮誘導的PC-12細胞存活率（＜0.05、0.01）；抑制細胞凋亡和細胞內ROS水平（＜0.01）；升高線粒體膜電位（＜0.01）；下調細胞Bax/Bcl-2蛋白表達（＜0.05）；上調BDNF蛋白表達（＜0.01）。酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，Trk B）拮抗劑K252a能夠拮抗地黃苷D對PC-12細胞凋亡的抑制作用。地黃苷D可能是通過激活BDNF-Trk B通路，抑制細胞凋亡通路，從而保護皮質酮誘導的PC-12細胞損傷。

地黃苷D；腦源性神經營養因子-酪氨酸激酶受體B通路；線粒體凋亡通路；皮質酮；抑郁癥

抑郁癥是臨床常見的心境障礙疾病，主要癥狀表現為情感低落、喪失興趣、注意力降低、思維遲緩、言語動作減少[1]。抑郁癥發病率呈逐年上升趨勢，據2019年世界衛生組織統計的最新數據顯示，全球大約有3.5億抑郁癥患者[2]。目前臨床常用的抗郁藥類型包括單胺氧化酶抑制劑（monoamine oxidase inhibitor，MAOI）、三環類藥物、選擇性5-羥色胺再吸收抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI）等[3]。但有報道指出，抗抑郁藥一般服用1～2周后才會逐漸起效，且一些患者服藥后產生性功能障礙、嗜睡、體質量增加、失眠、惡心等不良反應[4]。因此，從中藥中尋找抗抑郁新藥很有意義。本課題組近年來致力于從中藥中篩選出具有抗抑郁活性的化學成分，發掘抗抑郁新藥前體，以期開發出具有我國自主知識產權的抗抑郁新藥。

地黃是玄參科植物地黃Libosch.的塊根，列為四大懷藥之一。地黃藥用始載于《神農本草經》，后張仲景《金匱要略·百合狐惑陰陽毒病脈證治》中將百合地黃湯（由百合、生地黃2味藥物組成）用于治療百合病（一種以行、臥、飲食等皆覺不適及神情恍惚為主要表現的神志疾病）。現代藥理學研究已證實百合地黃湯能改善模型小鼠的抑郁癥狀[5]，還有研究指出地黃乙醇提取物能夠改善慢性不可預見性輕度應激誘發的抑郁樣行為[6]。因此，本課題組對近年來從地黃中提取、分離得到的化合物進行了抗抑郁活性篩選，發現從地黃中分離得到的地黃苷D對小鼠抑郁模型的抑郁癥狀有較好的改善作用。進一步查閱文獻發現，目前已有報道的地黃中的抗抑郁成分有梓醇[7]、毛蕊花糖苷[8]和松果菊苷[9]，關于地黃苷D抗抑郁活性的研究尚無報道。本研究采用皮質酮誘導的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC-12細胞）損傷模型，探究地黃苷D對PC-12細胞的保護作用，以及對神經營養因子表達和神經凋亡通路的影響。

1 材料

1.1 細胞株

PC-12細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥材

生地黃購自河南省焦作市溫縣，經河南中醫藥大學董誠明教授鑒定為玄參科多年生草本植物地黃Libosch.的干燥塊根，標本保存在河南中醫藥大學中藥化學研究室。

1.3 藥品與試劑

DiaionHP-20、MCIGelCHP-20購自日本三菱化學公司；ToyopearlHW-40C、ToyopearlHW-40購自日本TOSOH公司；SephadexLH-20購自美國Parmacia Biotech公司；160～200目柱色譜硅膠H購自青島海洋化工廠；RPMI 1640培養基（批號2110284）購自美國Gibco公司；胎牛血清（批號20010502）購自杭州四季青生物工程研究所；皮質酮（批號16063）購自美國Cayman Chemical Inc；氟西汀（批號T0450）購自上海百舜生物科技有限公司；DAPI（批號C1002）購自上海碧云天生物技術有限公司；雙抗、二甲基亞砜、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒、線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，批號分別為200200912、1121E0316、20210915、20210914；PE偶聯Annexin-V凋亡檢測試劑盒（批號9074586）購自美國BD公司；酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，Trk B）拮抗劑K252a（批號128M4104V）購自美國Sigma公司；胰酶（批號J190017）、MTT（批號715F055）購自Biosharp公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號ab13847）、B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抗體（批號ab59348）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號ab32503）、腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗體（批號ab205067）購自英國Abcam公司；剪切型Caspase-3（cleaved Caspase-3）抗體（批號9661S）購自美國CST公司；羊抗兔二抗（批號C80911-11）、羊抗鼠二抗（批號C80816-10）購自美國LI-COR公司；β-actin抗體（批號AC004）購自美國ABclonal公司；其他試劑均為進口或國產分析純。

1.4 儀器

Forma 3111型細胞培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；iMark酶標儀（美國Bio-Rad公司）；Arium611VF型超純水儀（德國Sartorius公司）；微量加樣器、5810型離心機（德國Eppendorf公司）；ECLIPSE TS100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；HVA-85型全自動高壓滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）；FACS Aria III流式細胞儀（美國BD公司）；Odyssey CLx雙色紅外激光成像系統（美國LI-COR公司）；高內涵成像分析系統（美國Perkin Elmer公司）；AB204-N型萬分之一精密分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；APEX II型質譜儀、AVANCE 500 III型核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；DFZ-3型真空干燥箱（上海醫用恒溫設備廠）。

2 方法

2.1 地黃苷D的制備

地黃苷D為本課題組制備[10]，具體方法：稱取20 kg生地黃，用10倍量的95%乙醇加熱回流提取2次，對提取液進行減壓、濃縮和離心，然后過柱洗脫。將得到的甲醇部位旋干并用10%甲醇溶液溶解濾過，濾液依次用10%、30%、50%、70%和100%甲醇水溶液洗脫；將10%甲醇部位用甲醇溶解，使用硅膠柱色譜結合ToyopearlHW-40、SephadexLH-20、MCI Gel CHP-20、ODS等進行分離純化及干燥。最后，通過光譜技術鑒定化合物的結構，確定得到的單體化合物SDH-1-15（36 mg）為地黃苷D，經高效液相色譜儀面積歸化一法測定質量分數為98.57%。

2.2 MTT法檢測細胞存活率

PC-12細胞以4×104/mL接種于96孔板中，設置對照組、模型組、氟西汀（0.3 μmol/L）組和地黃苷D（5、10、20 μmol/L）組。模型組和各給藥組加入500 μmol/L皮質酮，各給藥組再加入相應藥物，對照組加入不含藥物的培養基，處理24 h后，每孔加入20 μL MTT，4 h后采用酶標儀檢測490 nm處的吸光度（）值，計算細胞存活率[11]。

細胞存活率＝給藥/對照

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

PC-12細胞以8×104/mL接種于6孔板中，設置對照組、模型組、氟西汀（0.3 μmol/L）組和地黃苷D（10 μmol/L）組。模型組和各給藥組加入500 μmol/L皮質酮，各給藥組再加入相應藥物，對照組加入不含藥物的培養基，處理24 h后，收集貼壁細胞和上清中懸浮細胞，按照PE偶聯Annexin-V凋亡檢測試劑盒說明書進行操作后上機檢測，對2和42個象限的數值之和進行處理，統計為細胞凋亡率[12]。

2.4 流式細胞儀檢測細胞內ROS水平

細胞處理及分組同“2.3”項下方法，按照ROS檢測試劑盒說明書進行操作后在流式細胞儀上進行檢測，對P3的數值進行處理，統計為細胞內ROS含量[11]。

2.5 流式細胞儀檢測MMP

細胞處理及分組同“2.3”項下方法，按照MMP檢測試劑盒說明書進行操作后在流式細胞儀上進行檢測，對綠色熒光的數值進行處理，統計為線粒體中JC-1單體比率[13]。

2.6 In-Cell Western法檢測細胞凋亡通路關鍵蛋白表達

PC-12細胞以4×104/mL接種于96孔板中，分組同“2.3”項下方法，在給藥處理24 h后，吸取上清，依次用甲醛固定，Triton透化，牛血清白蛋白封閉2 h后，浸泡在Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2和β-actin一抗[均以1∶200溶于牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）]中過夜孵育，再以二抗（以1∶500溶于BSA）孵育1 h，然后PBST清洗4次，5 min/次；PBS清洗1次，5 min/次，采用Odyssey CLx雙色紅外激光成像系統掃描結果，對熒光數值進行處理，統計為蛋白表達量[11]。

2.7 高內涵細胞成像系統檢測BDNF蛋白表達

PC-12細胞以4×104/mL接種于96孔板中，設置對照組、對照＋K252a（10 nmol/L）組、模型組、模型＋K252a（10 nmol/L）組、氟西汀（0.3 μmol/L）組、氟西汀（0.3 μmol/L）＋K252a（10 nmol/L）組、地黃苷D（10 μmol/L）組和地黃苷D（10 μmol/L）＋K252a（10 nmol/L）組。除對照組和對照＋K252a組外，其余各組加入500 μmol/L皮質酮，各給藥組再加入相應藥物，對照組加入不含藥物的培養基，處理24 h后，吸取上清，依次用甲醛固定，Triton透化，封閉液封閉，一抗孵育（均以1∶200溶于BSA）過夜，二抗（均以1∶500溶于BSA）孵育1 h，然后加入2 μg/mL的DAPI復染5 min，然后用PBS清洗2次，5 min/次，采用Opera Phenix高內涵篩選系統檢測結果，對熒光數值進行處理，統計為蛋白表達量[14]。

2.8 流式細胞儀檢測K252a處理后的細胞凋亡情況

細胞處理及分組同“2.7”項下方法，按照PE偶聯Annexin-V凋亡檢測試劑盒說明書進行處理后，在流式細胞儀上進行檢測，對2和42個象限的數值之和進行處理，統計為細胞凋亡率[12]。

2.9 統計學分析

3 結果

3.1 地黃苷D對皮質酮誘導的PC-12細胞存活率的影響

如圖1所示，與對照組相比，模型組細胞存活率顯著降低（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組細胞存活率均顯著升高（＜0.05、0.01），因此后續采用10 μmol/L地黃苷D進行實驗。

3.2 地黃苷D對皮質酮誘導的PC-12細胞凋亡的影響

如圖2所示，與對照組相比，模型組細胞凋亡率顯著升高（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組細胞凋亡率均顯著降低（＜0.01），表明地黃苷D能夠緩解細胞損傷。

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下圖同

圖2 地黃苷D對皮質酮誘導的PC-12細胞凋亡的影響(, n = 3)

3.3 地黃苷D對皮質酮誘導的PC-12細胞內ROS水平的影響

如圖3所示，與對照組相比，模型組細胞內ROS水平顯著升高（＜0.01），細胞內氧化應激水平增加；與模型組相比，各給藥組細胞內ROS水平顯著降低（＜0.05、0.01），細胞內氧化應激損傷降低。

3.4 地黃苷D對皮質酮誘導的PC-12細胞MMP的影響

如圖4所示，與對照組相比，模型組細胞內JC-1單體比率顯著升高（＜0.01），即MMP降低，線粒體功能下降；與模型組相比，各給藥組細胞內JC-1單體比率顯著降低（＜0.01），MMP升高，細胞損傷得到改善。

3.5 地黃苷D對皮質酮誘導損傷的PC-12細胞凋亡蛋白的影響

如圖5所示，與對照組相比，模型組細胞cleaved Caspase-3/Caspase-3和Bax/Bcl-2均顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組相比，各給藥組細胞Bax/Bcl-2均顯著降低（＜0.05），cleaved Caspase-3/ Caspase-3降低，但不具有顯著性差異，表明地黃苷D能夠抑制皮質酮誘導的細胞凋亡進程。

圖3 地黃苷D對皮質酮誘導的PC-12細胞內ROS水平的影響(, n = 3)

圖4 地黃苷D對皮質酮誘導的PC-12細胞MMP的影響(, n = 3)

圖5 地黃苷D對皮質酮誘導的PC-12細胞凋亡相關蛋白表達的影響(, n = 3)

3.6 地黃苷D對皮質酮誘導的PC-12細胞BDNF蛋白表達的影響

如圖6所示，與對照組相比，模型組細胞BDNF蛋白表達顯著降低（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組細胞BDNF蛋白表達顯著升高（＜0.01）；給予K252a后，各給藥組細胞BDNF蛋白表達顯著降低（＜0.05），表明K252a可拮抗地黃苷D對細胞的保護作用。

與氟西汀組比較：&P＜0.05；與地黃苷D組比較：△P＜0.05

3.7 K252a拮抗地黃苷D對皮質酮誘導的PC-12細胞凋亡的抑制作用

如圖7所示，與對照組相比，模型組細胞凋亡率顯著升高（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組細胞凋亡率顯著降低（＜0.01）；給予K252a后，各給藥組細胞凋亡率顯著升高（＜0.05、0.01），表明K252a拮抗了地黃苷D對PC-12細胞凋亡的抑制作用，表明地黃苷D的抗凋亡作用可能是通過BDNF-TrkB通路介導的。

4 討論

抑郁癥的重要表現包括過高的糖皮質激素和皮質酮水平，兩者均可誘發神經元和膠質細胞相關的凋亡、自噬和突觸可塑性的改變等病理變化[15]。因此可采用皮質酮刺激神經元細胞來模擬抑郁癥的內環境，建立抑郁癥體外細胞模型。PC-12細胞由于具有典型的神經元和糖皮質激素受體特征，常被應用于研究神經元損傷的體外模型[16]。因此，本研究采用皮質酮誘導損傷PC-12細胞建立抑郁模型，探究地黃苷D是否能夠改善細胞損傷，并進一步探究其可能的作用機制。

抑郁癥的發病與應激密切相關，大腦的海馬結構最易受到高活性自由基如ROS應激反應損害，從而導致海馬神經細胞凋亡，故抑郁癥、ROS與神經細胞凋亡3者之間有密切聯系[17]。臨床研究和實驗研究均發現，抑郁癥患者和模型動物均表現出抗氧化物質的減少和氧化通路的激活[18]，抑郁癥常用藥物氟西汀的抗抑郁機制涉及到其抗氧化及抑制中樞氧化應激性損傷的功能[19]。線粒體是提供三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的主要場所，線粒體合成的ATP為機體提供能量，因此，線粒體功能對于維持細胞正常功能至關重要。線粒體具有雙層膜結構，其內外膜通透性的差異可以使線粒體內膜兩側形成質子梯度，維持MMP。正常的MMP是維持線粒體進行氧化磷酸化、產生ATP的先決條件，MMP的穩定有利于維持細胞的正常生理功能[20]。線粒體酶呼吸鏈可產生ROS，一些刺激會導致ROS水平異常增高，從而導致線粒體膜通透性改變，引起MMP的降低，誘導線粒體功能紊亂[21]。近年來研究發現，多種細胞在不同因子作用下發生凋亡時均伴有MMP的下降，且MMP在細胞凋亡早期病理變化以前就開始下降，該過程早于DNA片段化[22]。本研究結果顯示，皮質酮誘導后的細胞ROS水平上升，MMP明顯下降，凋亡水平明顯上升；地黃苷D給藥后有效抑制了ROS水平，提升了MMP水平，降低了凋亡水平。

與氟西汀組比較：&P＜0.05；與地黃苷D組比較：△△P＜0.01

細胞凋亡途徑根據啟動過程主要包括線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網途徑3種途徑，而線粒體途徑在介導細胞凋亡中承擔著重要角色[23]。當氧化應激發生時，ROS過度積累，導致機體抗氧化系統紊亂，體內氧自由基代謝失衡誘導神經細胞線粒體氧化應激，損傷線粒體，使細胞MMP下降，進而導致線粒體膜通透性發生改變，從而促進一系列凋亡因子（如Bcl-2家族、Caspase家族等）釋放，引起細胞凋亡[22]。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡和線粒體外膜完整性的調控中都有很重要的功能。Bax是最早發現的Bcl-2家族促凋亡蛋白，它在正常細胞中主要定位于細胞質，受到凋亡刺激后發生構象變化，轉位到線粒體上，直接寡聚化或與線粒體膜通透性轉換孔道相互作用，在線粒體的外膜形成大的孔道，引起細胞色素C的釋放，激活下游Caspases凋亡反應[24]。Bcl-2可以通過抑制Bax孔道的形成抑制凋亡。Caspases是一組存在于細胞質中的具有相似結構的天冬氨酸蛋白水解酶，其級聯反應是細胞凋亡的執行者[25]。Bax/Bcl-2值的增加能夠誘導線粒體功能障礙，從而釋放一些凋亡相關因子，激活下游細胞凋亡過程中關鍵的執行分子之一Caspase-3的表達，使其被切割活化為cleaved Caspase-3，進而誘導細胞凋亡[26]。抗抑郁藥物可以通過調節神經細胞凋亡通路的關鍵蛋白的表達水平來調節細胞凋亡[27]。本研究結果顯示，經皮質酮刺激后，細胞內凋亡通路關鍵蛋白cleaved Caspase-3/Caspase-3和Bax/Bcl-2值均明顯上升；經地黃苷D處理后，Bax/Bcl-2和cleaved Caspase-3/Caspase-3的比值均有不同程度地降低，表明地黃苷D能夠通過抑制線粒體凋亡途徑，保護PC-12細胞免受皮質酮損傷。

研究發現，BDNF是抗抑郁藥物的重要靶點[28]。BDNF在海馬和皮層高表達，由神經元合成，是5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）能神經元的生長因子，可以營養和保護5-HT能神經元，促進神經元生長，促使神經突觸重塑，促進神經遞質的合成。有研究表明，激發抑郁癥產生的神經源性壓力可促使BDNF表達降低[29]。給予藥物治療后，抑郁模型大鼠腦內BDNF含量增加[30]。臨床研究也發現，抗抑郁藥物或電休克治療后，BDNF水平升高[31]。進一步查閱文獻發現，BDNF的抗抑郁作用可通過Trk B激活、-甲基--天冬氨酸受體（-methyl--aspartic acid receptor，NMDA）受體活性增強以及抗氧化3條途徑來實現，其中Trk B受體激活可以通過2個方面來實現，一是BDNF和Trk B結合后，使環磷腺苷效應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）磷酸化，CREB在神經系統發育、抑郁、成癮、生理周期調控和長期記憶的形成中發揮重要作用；二是Trk B與BDNF結合被激活后，Trk B形成同型二聚體，導致酪氨酸殘基磷酸化，進而激活其下游多條信號通路，包括磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）、細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）和磷脂酶C（phospho-1ipase C，PLC)這些有助于神經元正常發育生存與分化的信號轉導通路，進而發揮抗抑郁作用[28]。因此，Trk B在BDNF發揮抗抑郁作用的過程中有著重要意義。K252a是Trk B拮抗劑，可以通過阻斷BDNF與其受體Trk B的結合，阻斷BDNF-Trk B通路[32]。在免疫熒光檢測結果中發現，皮質酮誘導后PC-12細胞內BDNF表達明顯下降，而地黃苷D能有效提高細胞內BDNF表達，從而改善細胞損傷。進一步研究發現，給予K252a后，地黃苷D對PC12細胞BDNF表達的上調作用明顯減弱，表明K252a可以拮抗地黃苷D的神經保護作用，表明BDNF-Trk B通路是地黃苷D的神經保護作用的相關通路，BDNF是地黃苷D發揮抗抑郁作用的靶點之一。本研究結果表明，地黃苷D發揮抗抑郁作用，一方面是由于抑制了高濃度皮質酮誘導的神經細胞凋亡，另一方面是由于提高BDNF表達，促進神經細胞的生長和修復，保護神經細胞，2種作用相互促進，共同發揮抗抑郁作用。

有研究指出，機體內BDNF表達的上升可以下調Bax、Caspase-3的表達，從而發揮抗凋亡作用而保護神經細胞[33]。還有研究者發現當BDNF與Trk B結合并磷酸化酪氨酸515位點時，還會激活PI3K-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路，進而抑制凋亡通路的啟動[34]。因此本研究進一步考察了加入TrkB拮抗劑K252a后，在阻斷BDNF-Trk B通路的情況下對凋亡水平的影響。結果發現，地黃苷D對PC-12細胞凋亡的抑制作用可以被K252a拮抗，表明BDNF-Trk B通路可能處于凋亡通路的上游，地黃苷D抑制凋亡通路可能是由BDNF-TrkB通路介導的。

綜上所述，地黃苷D可能是地黃發揮抗抑郁作用的重要物質基礎之一。地黃苷D可有效緩解由高濃度皮質酮誘導的PC-12細胞損傷，其作用機制可能為提高BDNF表達，并通過BDNF-TrkB通路發揮抗凋亡作用，最終保護神經細胞，從而發揮抗抑郁作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 劉宗鳳. 腦電指標與老年抑郁癥的相關性研究 [J]. 山東醫學高等專科學校學報, 2021, 43(3): 215-217.

[2] Taciak P P, Lysenko N, Mazurek A P. Drugs which influence serotonin transporter and serotonergic receptors: Pharmacological and clinical properties in the treatment of depression [J]., 2018, 70(1): 37-46.

[3] 王建軍, 張文廣. 抑郁癥治療中藥物相互作用引起的反應 [J]. 兵團醫學, 2017, 52(2): 58-60.

[4] Braund T A, Tillman G, Palmer D M,. Antidepressant side effects and their impact on treatment outcome in people with major depressive disorder: An iSPOT-D report [J]., 2021, 11(1): 417.

[5] 趙洪慶, 唐林, 吳碧茹, 等. 百合地黃湯抑制NLRP3炎癥小體激活改善焦慮性抑郁癥模型大鼠海馬神經元損傷 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2021, 27(20): 7-14.

[6] Wang J M, Pei L X, Zhang Y Y,. Ethanol extract ofexerts antidepressant-like effects on a rat chronic unpredictable mild stress model by involving monoamines and BDNF [J]., 2018, 33(3): 885-892.

[7] 張江南, 劉克辛. 梓醇的研究進展 [J]. 藥物評價研究, 2019, 42(8): 1680-1684.

[8] 王維剛, 王芃, 陽志強, 等. 毛蕊花糖苷藥理作用研究進展 [J]. 國際藥學研究雜志, 2020, 47(12): 1078-1087.

[9] 王慧慧, 盧仁睿, 張莉, 等. 地黃中松果菊苷對皮質酮誘導PC-12細胞凋亡的抑制作用及機制研究 [J]. 中國臨床藥理學雜志, 2021, 37(18): 2447-2450.

[10] 馮衛生, 李孟, 鄭曉珂, 等. 生地黃化學成分研究 [J]. 中國藥學雜志, 2014, 49(17): 1496-1502.

[11] 張莉, 王慧慧, 徐瑞豪, 等. 皂角刺提取物對皮質酮誘導PC-12細胞損傷的保護作用研究 [J]. 中藥材, 2020, 43(6): 1473-1477.

[12] 馮衛生, 楊方方, 張莉, 等. 南葶藶子水提物對多柔比星誘導H9c2細胞凋亡和氧化應激的抑制作用 [J]. 中國藥學雜志, 2018, 53(23): 1999-2007.

[13] 鄭曉珂, 楊方方, 張莉, 等. 南葶藶子抑制氧化應激與自噬通路抗H2O2誘導的H9c2細胞損傷作用研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(1): 157-165.

[14] 張雯, 宋俊科, 朱曉瑜, 等. 異鼠李素激活Sirt1/PGC-1α信號通路抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷 [J]. 藥學學報, 2019, 54(11): 1976-1981.

[15] 趙慧亮, 高耀, 向歡, 等. 復方柴歸方對皮質酮誘導PC12細胞損傷的保護作用及轉錄組學機制研究 [J]. 中藥藥理與臨床, 2021, 37(2): 126-132.

[16] Jin W Q, Xu X H, Chen X N,. Protective effect of pig brain polypeptides against corticosterone-induced oxidative stress, inflammatory response, and apoptosis in PC12 cells [J]., 2019, 115: 108890.

[17] 孫陽, 圖婭, 郭郁, 等. 針刺對慢性束縛應激抑郁模型大鼠海馬凋亡相關因子的影響 [J]. 針刺研究, 2019, 44(6): 412-418.

[18] Abuelezz S A, Hendawy N, Magdy Y. Targeting oxidative stress, cytokines and serotonin interactions via indoleamine 2,3 dioxygenase by coenzyme Q10: Role in suppressing depressive like behavior in rats [J]., 2017, 12(2): 277-291.

[19] Safhi M M, Qumayri H M, Masmali A U M,. Thymoquinone and fluoxetine alleviate depression via attenuating oxidative damage and inflammatory markers in type-2 diabetic rats [J]., 2019, 125(2): 150-155.

[20] 劉珂娣, 段佳林, 蘇晶, 等. 紫鉚花素對PC12細胞氧化應激損傷的保護作用及對線粒體功能的影響研究 [J]. 中國藥房, 2020, 31(24): 2974-2981.

[21] Anderson G, Maes M. Oxidative/nitrosative stress and immuno-inflammatory pathways in depression: Treatment implications [J]., 2014, 20(23): 3812-3847.

[22] 武冬, 符瑩瑩, 劉丹平, 等. 艾司洛爾對膿毒癥大鼠心肌細胞線粒體膜電位及心肌組織NF-κB表達的影響 [J]. 生物醫學工程與臨床, 2019, 23(4): 379-386.

[23] 朱玲玲, 趙捷平, 竇勤玲, 等. 線粒體凋亡途徑在槲皮素誘導U937細胞凋亡中的作用研究 [J]. 中國免疫學雜志, 2018, 34(10): 1466-1471.

[24] 馬淇, 劉壘, 陳佺. 活性氧、線粒體通透性轉換與細胞凋亡 [J]. 生物物理學報, 2012, 28(7): 523-536.

[25] 王瓏, 王實濤. 抑郁癥氧化應激發病機制及針刺治療研究進展 [J]. 針灸臨床雜志, 2017, 33(11): 76-80.

[26] 王春景, 盛月, 周強, 等. 香葉木素通過線粒體凋亡途徑對人乳腺癌MCF-7細胞增殖及凋亡的影響 [J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2020, 31(2): 149-155.

[27] 劉林, 劉檢, 劉羽, 等. 百事樂加味方對腦卒中后抑郁模型大鼠海馬-前額葉皮層神經細胞凋亡蛋白的影響 [J]. 中國中醫藥信息雜志, 2019, 26(4): 61-67.

[28] 徐嘉珂, 白潔. BDNF及其受體在抗抑郁癥中的作用及其機制研究 [J]. 生命科學, 2014, 26(4): 357-361.

[29] 張峻, 孟虹媛, 楊偉. 百樂眠膠囊聯合喹硫平治療輕中度抑郁癥的臨床研究 [J]. 現代藥物與臨床, 2021, 36(8): 1599-1603.

[30] 鄒海艷, 楊亦龍, 屠蘅菁, 等. 解郁安神中藥對抑郁模型大鼠神經遞質及腦源性神經營養因子的影響 [J]. 北京中醫藥大學學報, 2015, 38(9): 611-618.

[31] Zhu J X, Hu W Q, Dong S Q,. Hippocampal BDNF signaling is required for the antidepressant effects of perillaldehyde [J]., 2019, 71(3): 430-437.

[32] 張繼紅, 李愛敏, 陳松, 等. 阻斷TrkB-BDNF信號傳導通路對神經母細胞瘤細胞生長及凋亡的影響 [J]. 中國當代兒科雜志, 2008, 10(1): 47-50.

[33] 屈紅林, 謝軍, 陳嘉勤, 等. 有氧運動激活BDNF/miR-195/Bcl-2信號通路抑制CUMS抑郁小鼠海馬神經細胞凋亡 [J]. 天津體育學院學報, 2018, 33(2): 148-155.

[34] 甘世明, 金戈. BDNF信號通路調節學習記憶的研究進展 [J]. 中國老年學雜志, 2019, 39(13): 3325-3330.

Protective effect and mechanism of rehmannioside D on PC-12 cells injury induced by corticosterone

ZHANG Li1, LU Ren-rui1, WANG Hui-hui1, LI Meng1, FENG Wei-sheng1, 2, ZHENG Xiao-ke1, 2

1. School of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Henan Engineering Technology Research Center for Chinese Medicine Development, Zhengzhou 450046, China

To study the protective effect and mechanism of rehmangoside D isolated fromon PC-12 cells induced by corticosterone.PC-12 cells were treated with 500 μmol/L corticosterone for 24 h to establish an injury model, fluoxetine and rehmangoside D were given for intervention at the same time. Cell viability was detected by MTT method; Intracellular apoptosis, reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial membrane potential levels were determined by flow cytometry; In-Cell Western method was used to detect intracellular apoptosis-related protein cysteine-aspartate protease-3 (Caspase-3), cleaved Caspase-3, B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) and Bcl-2 associated X protein (Bax) expressions; High-content cell imaging system was used to detect intracellular brain-derived neurotrophic factor (BDNF) protein expression.Rehmangoside D significantly increased the survival rate of PC-12 cells induced by corticosterone (< 0.05, 0.01), inhibited cell apoptosis and intracellular ROS level (< 0.01), increased mitochondrial membrane potential (< 0.01); Expression of Bax/Bcl-2 protein was down-regulated (< 0.05); BDNF protein expression was up-regulated (< 0.01). Tyrosine kinase receptor B (Trk B) antagonist K252a could antagonize the inhibitory effect of rehmangoside D on apoptosis of PC-12 cells.Rehmangoside D may protect PC-12 cells from corticosterone-induced injury by activating BDNF-Trk B pathway and inhibiting apoptosis pathway.

rehmannioside D; brain-derived neurotrophic factor-tyrosine kinase receptor B pathway; mitochondria dependent apoptotic pathway; corticosterone; depression

R285.5

A

0253 - 2670(2022)11 - 3385 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.014

2022-02-17

國家重點研發計劃項目（2017YFC1702800）；河南省重大科技專項（171100310500）；河南省高層次人才特殊支持“中原千人計劃”項目（ZYQR201810080）；河南省教育廳河南省科技攻關項目（212102311106）；河南省中醫藥科學研究專項課題（20-21ZY2151）；國家留學基金委訪問學者項目（201908410093）；河南中醫藥大學2018年度博士科研基金資助項目（BSJJ2018-04）

張 莉（1986—），女，博士，從事中藥藥效物質基礎及作用機制研究。E-mail: sonny.fairy.love@163.com

馮衛生，男，教授，從事中藥藥效物質基礎及作用機制研究。E-mail: fwsh@hactcm.edu.cn

鄭曉珂，女，教授，從事中藥活性及其作用機制研究。Tel: (0371)60190296 E-mail: zhengxk.2006@163.com

[責任編輯 李亞楠]