基于葉綠素熒光參數評估蝴蝶蘭的組織培養潛力

朱珈葉　李丹丹　 陳倩　印麗萍　郭水良

摘? 要： 以蝴蝶蘭（ RcHb.F.）的“大辣椒”品種為對象，研究了不同高溫脅迫處理時間下的蝴蝶蘭形態、葉綠素熒光參數變化，并對處理過的蝴蝶蘭材料進行了組織培養.結果發現：當蝴蝶蘭“大辣椒”品種莖段的PSⅡ最大光化學量子產量（/）低于0.35時，其無法作為外植體進行組織培養.與蝴蝶蘭葉片相比，莖段的/更能夠指示蝴蝶蘭組織培養的成功概率.

關鍵詞： 蝴蝶蘭; 莖段; 葉片; PSⅡ最大光化學量子產量（/）; 組織培養

中圖分類號： Q 945??? 文獻標志碼： A??? 文章編號： 1000-5137（2022）02-0251-06

Potential evaluation of tissue culture for by using chlorophyll fluorescence parameters

ZHU JiayeLI DandanCHEN QianYIN LipingGUO Shuiliang

（1.College of Life Sciences， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China;2.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Shanghai 200315， China）

“Dalajiao” is a common variety of The individuals of the variety were cultured at a high temperature of 35 ℃， 14 h light/d with different durations. Throughout the treatment， their morphological changes were observed and the chlorophyll fluorescence parameters including the maximum quantum efficiency of photosystem II （PSⅡ） photochemistry（/）， electron transfer rate under different light intensities were determined. Their corresponding explants were cultured to evaluate the potential for successful reproduction . We found that there existed a positive correlation between / of the stems and the successful rate of tissue culture with corresponding stems. When / of stems was less than or equal to 0.35， the stems were unable to be cultured because of lacking vitality. The / of the stems is better than that of the leaves in indicating their potential as explants for tissue culture.

; stem; leaf; photosystem Ⅱ （PSⅡ） photochemistry（/）; tissue culture

蝴蝶蘭（ RcHb.F.）是蘭科附生單莖性植物.由于其形態和結構上均與眾不同，且外形具有娥蝶般的美麗，故以蝴蝶蘭來命名.蝴蝶蘭為多年生常綠草本，是熱帶/亞熱帶氣生蘭.中國云南南部、西藏南部、廣東南部、海南及臺灣為該屬植物的自然分布的北界.蝴蝶蘭在國內外鮮花市場上深受歡迎，具有很高的觀賞價值和經濟價值.

隨著蘭花種植業的發展，蝴蝶蘭的組織培養發展迅速.早在1949年，人們利用蝴蝶蘭花梗腋芽成功地進行了組織培養，正式提出了一種蝴蝶蘭屬植物營養繁殖的方法，實現了蝴蝶蘭試管繁殖.蝴蝶蘭的莖尖、莖段和幼葉、花梗腋芽、花梗節間、根尖等部位都可做離體組織培養的外植體.但是葉片的誘導成功率很低.蝴蝶蘭不同外植體的成活率有差異，其中花梗側芽的成活率最高，達75.0%，其次為花梗，成活率為62.5%，葉片和根尖最差，分別為12.5%和7.5%.

蝴蝶蘭組培的基本培養基包括Murashige and Skoog （MS）培養基，1/2 MS培養基，Vacin and Went （VW）蘭科植物培養基，Gamborg’s B-5培養基，Knudson C （KC）培養基，Kyoto so1ution花肥培養基，花寶及其改良型等.但不同品種的蝴蝶蘭以及取用不同部位的外植體，最適培養基的選擇也有所不同.1/2MS或改良MS較MS效果好，減少MS中大量元素和部分微量元素及有機成分，適當增加少量的葉酸，有利于原球莖的增殖生長.植物組織培養中常添加一些天然有機物.如椰子汁、馬鈴薯汁和香蕉汁可提高蝴蝶蘭原球莖的增殖率.蝴蝶蘭組培中常用的細胞分裂素為6-BA，質量濃度較高（1～8 mg?L）的6-BA能促進蝴蝶蘭原球莖增殖，質量濃度較低（0.1～0.5 mg?L）的6-BA能促進原球莖分化.

蝴蝶蘭在生長發育期對高溫敏感，在高溫脅迫下極易受到抑制和危害.其最適宜生長的溫度是18～28 ℃.溫度過高會導致蝴蝶蘭細胞內活性氧（ROS）大量積累，使其代謝紊亂，從而導致植株生長緩慢甚至死亡.恒溫30 ℃處理24 h能顯著提高蝴蝶蘭抗氧化酶活性，然而40 ℃處理會破壞抗氧化酶系統.關于蝴蝶蘭高溫脅迫方面的研究，主要集中在赤霉素、細胞分裂素與成花的關系，高溫脅迫下蝴蝶蘭的防御機制和傷害機理，蝴蝶蘭的高溫脫毒，以及耐熱性的誘導及抗熱害栽培等方面.

隨著中國對外交流的擴大，園藝植物進出口頻繁.目前國內外對蝴蝶蘭的研究主要集中在組織快速繁殖體系的建立、滅菌方法、降低褐化，及對脅迫的生理響應等方面，但很少有關于環境脅迫對蝴蝶蘭可組培性影響的研究.蝴蝶蘭作為蘭科珍貴的園藝種源，為防止其種源流失，同時也為利用境外蝴蝶蘭種源，建立對蝴蝶蘭植株活力的快速檢測方法，具有實際應用價值.本研究分別以蝴蝶蘭無菌試管苗為材料，研究了高溫脅迫條件下蝴蝶蘭的葉綠素熒光參數變化，及其與蝴蝶蘭生長繁殖潛力之間的關系，旨在建立蝴蝶蘭植株活力的快速檢測方法.

1? 材料與方法

培養材料為蝴蝶蘭“大辣椒”品種3個月組培苗，購自濰坊市濰城區南關花卉市場.

選取株齡、株高、生勢、葉色基本一致的3個月齡的蝴蝶蘭“大辣椒”組培苗植株，放置在無菌瓶中，每瓶一株，于光照培養箱中培養.培養條件為：溫度35 ℃，光照12 h·d，空氣相對濕度70% RH，光照強度2 000 lx.對照的溫度為（25±2）℃，光照12 h·d.

每隔2 d取出高溫處理的蝴蝶蘭幼苗植株，暗適應20 min后，采用便攜式調制葉綠素熒光儀PAM，分別測定蝴蝶蘭兩個品種莖段和第二片葉的PSⅡ最大光化學量子產量（/）.每個處理重復3次.同樣每隔2 d取出高溫處理的蝴蝶蘭幼苗植株進行可組培性研究，切去根部和葉子，保留莖段部位進行組培.

接種培養基為：花寶1號（質量濃度3 g?L）+6-BA（質量濃度5.0 mg?L）+NAA（質量濃度0.5 mg?L）+蔗糖（質量濃度30 g?L）+椰汁（體積分數200 mL?L）+瓊脂（質量濃度6 g?L）+活性炭（質量濃度1 g?L）+pH值6.0.接種后的莖段放置在無菌培養室中培養，培養條件為（25±2）℃，光源為普通熒光燈，光照度約1 500～2 000 lx，光照時間為12 h?d.每個處理設5次重復.培養75 d后觀測蝴蝶蘭成苗情況，以形成葉片、叢生芽為組培成功標準.

2? 結果與分析

高溫脅迫下蝴蝶蘭“大辣椒”品種的形態變化

對照處理的蝴蝶蘭植株，在實驗期間均保持良好生長狀態.高溫處理下，“大辣椒”品種在第10天開始變黃，第22天大部分發黃枯萎（圖1）.

高溫脅迫下蝴蝶蘭“大辣椒”品種葉片和莖段/值

高溫脅迫下，隨著處理時間的延長，蝴蝶蘭的葉片/值不斷下降，第21天后，該指標急劇下降，到第24天時為0.與葉片相比，莖段的/值下降的相對平緩，到第24天時/值為0.35.

高溫脅迫處理下，隨著處理時間的延長，蝴蝶蘭莖段/值整體呈不斷下降的趨勢，處理20 d后，/值為0.35，仍有一定活力.高溫脅迫下，莖段的最大量子產量下降程度弱于葉片（圖2）.

測定不同波長的光合有效輻射（PAR）下蝴蝶蘭的光合電子傳遞速率（ETR），得到快速光響應曲線.發現在高溫脅迫處理下，隨著處理時間的延長，快速光響應曲線整體呈不斷下降的趨勢，第22天時光響應曲線降到最低，但是仍然有一定活性，整體趨勢與高溫脅迫下“大辣椒”莖段/值的變化趨勢一致（圖3）.

高溫脅迫下兩種蝴蝶品種葉片/值與可組培相關性

蝴蝶蘭“大辣椒”品種在高溫脅迫環境下14 d后，外植體組培成功率都為100%;第16天時，組培成功率降到了67%;第22天時為33%;第24天以后為0.與“黃花紅心”品種相比，“大辣椒”品種在高溫脅迫下不管是/值變化，還是外植體的組培可繁育能力，相應指標下降的速率都更為緩慢.

高溫脅迫環境下蝴蝶蘭幼苗的可組培性與其葉片的/值正相關.由于測量/值的部位為葉片，進行可組培性探究的部位為莖段，莖段可組培性與其葉片的F/值對應性不是很強.

在高溫處理12 d后，“大辣椒”品種莖段的/值大于0.5，組培成功率都在80%以上;/值低于0.5以后，可組培成功率依次遞減;當/值小于0.35時，組培成功率均為0.由于組培部分用的是切掉根部和葉子的蝴蝶蘭莖段作外植體，高溫脅迫下蝴蝶蘭莖段的_v/值與可組培相關性更為直接.蝴蝶蘭莖段是組培性探究的實驗材料，直接測量莖段的葉綠素熒光參數，特別是/值，能夠很好地指示蝴蝶蘭的可組織培養成功率（表1）.

3? 討論

高溫脅迫下，蝴蝶蘭幼苗PSⅡ反應中心出現了可逆或不可逆失活，降低了原初光能轉換效率，對光合機構和光合色素產生光氧化破壞.不同的蝴蝶蘭品種對高溫脅迫處理的耐受性不同，由于“大辣椒”品種的葉片比較肥厚，蘊藏水分比較多，在高溫脅迫下的耐受力比其他品種更強.今后將在更多的蝴蝶蘭品種中開展實驗研究，以評估不同品種對高溫脅迫的耐受力.

隨著高溫脅迫處理時間的延長，蝴蝶蘭莖段/值整體也呈不斷下降的趨勢，與高溫處理蝴蝶蘭葉片相比，莖段的/值變化較緩，而且其與蝴蝶蘭的組培成功率之間的相關性更加緊密和直接.高溫處理20 d后，蝴蝶蘭“大辣椒”莖段的/值下降為0.35，此種情況下莖段已經失去進行擴繁的活力.因此，蝴蝶蘭莖段/值0.35可以作為一個判別莖段是否能夠成為外植體進行組培擴繁的閾值.研究蝴蝶蘭幼苗在高溫脅迫環境下的葉綠素熒光參數的變化與其可組培性的關系，不僅可以為蝴蝶蘭規模化生產提供實質性的參考建議，更能為海關檢驗檢疫局管控蝴蝶蘭出入境情況提供幫助.

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（責任編輯：顧浩然）