如何證明植物生物刺激劑的功效聲明

申繼忠，余武秀

(上海艾農國際貿易有限公司，上海 200122)

已經出臺的歐盟肥料法規提出基于功效聲明(主張)的植物生物刺激劑定義。“植物生物刺激劑”是指促進植物營養的吸收和轉化而不提供營養物質的產品，目的是改進植物的下列特征中的一項或多項: 養分利用效率，對非生物脅迫的耐受性，作物品質性狀或土壤和根際土壤中被限制的營養物質的有效性。法規也明確規定了植物生物刺激劑“應具有產品標簽上功效聲明的效果”[1]。這就使得制造商有責任向監管機構和消費者證明產品功效聲明是合理的。因此，對某一特定的植物生物刺激劑證明其農藝學上的功效聲明是使其能夠被投放到市場的重要因素。

目前全世界范圍內生物刺激劑的監管還都處于起步階段，有很多問題尚待明確。中國目前尚無生物刺激劑的官方定義，更沒有專門的監管措施[2]。因此，作為刺激劑產品都是廠家自己的功效聲明，市場上的生物刺激劑產品也相對混亂。生物刺激劑的有效成分可能具有多種生物活性，功效聲明其具有刺激劑作用必須有充分的證據，這些證據可以來自田間驗證試驗、現有文獻等多個方面。但是功效聲明具有刺激劑作用必須遵守一定的原則，否則就會產生混亂。這方面的工作，目前只有歐盟和美國在進行中。歐盟生物刺激劑工業委員會(EBIC)提出了功效聲明產品具有刺激劑作用應遵守的一般性原則，目的是為歐洲肥料法規中生物刺激劑產品制定標準提供參考[2]。美國環保署發布了“植物生長調節劑包括生物刺激劑產品標簽聲明指導草案(2019)”[3]以及“植物生長調節劑包括生物刺激劑產品聲明指導草案(2020)”[4,5]。本文僅就EBIC 提出的“證明生物刺激劑功效聲明的一般原則”作簡要介紹，以供國內主管部門和業界參考。

1 歐盟肥料法規

新的歐盟肥料法規于2019 年6 月25 日發布，2019 年7 月15 日開始生效，2022 年7 月16 日開始全面實施[1]。

新的肥料法規將生物刺激劑納入肥料管理范疇，與植物保護產品(農藥)分開監管。新的歐盟肥料法規涵蓋6 種產品(肥料、石灰質材料、土壤改良劑、生長介質、抑制劑、植物生物刺激劑)以及它們的組合物(表1)。其中生物刺激劑包括微生物刺激劑和非微生物刺激劑。在此法規中，沒有微生物肥料的概念，說明此類物質都可以歸入微生物類刺激劑。

表1 歐盟肥料法規包括的肥料產品類別[1]

歐盟肥料法規還對每類產品所使用的原材料進行了規范，共分為11 類原材料(表2)。其中第7 類(CMC 7)是微生物類生物刺激劑推薦使用的微生物種類。當然在實際生產中，也可以使用其他類微生物。

表2 歐盟肥料產品原料組分分類(CMCs)[1]

續表2

2022 年7 月16 日之前，還需要為法規的實施制定一系列執行標準。這項工作由歐洲標準化委員會負責。

歐洲標準化委員會(CEN)專門制定歐洲標準(ENs)，適用于整個歐洲單一市場。CEN 匯集了34個國家的國家標準機構和由數千個來自商業聯盟、商業和消費者的技術專家組織、環境團體和其他社會利益相關者。它被歐洲委員會授權開發標準支持肥料產品法規的實施，在這種情況下CEN 于2017年創建了CEN/TC 455 植物生物刺激劑技術委員會，專門負責開發生物刺激劑相關標準(表3)。法國標準化協會(AFNOR)被指定為CEN/TC 455 第二工作組(WG 2)的負責機構，專門制定生物刺激劑功效聲明的標準(表3)。

表3 CEN/TC 455 生物刺激劑技術分委會和工作組[6,7]

2 證明植物生物刺激劑功效聲明的一般原則

2.1 生物刺激劑的定義及其對功效聲明的要求

植物生物刺激劑的定義是基于產品功效聲明的(歐洲委員會，2016；歐盟理事會，2018)，意思是用產品功能而不是用產品所含的成分來定義生物刺激劑。因此，證明一種產品確實是真正的生物刺激劑取決于對它的效果的證明。但是，這不能被視為要求保證產品具有特定水平的效果。在任何情況下，將生物刺激劑投放歐盟市場都不應被視為保證在所有條件下的有效性，因為許多因素可能會影響生物刺激劑在現場的性能。

制造商應該提供足夠可信的數據，而不是讓這個過程變成不必要的負擔。為產品功效聲明提供可靠的科學支持是歐洲生物刺激劑工業理事會(EBIC)工作的核心原則之一，而EBIC 也從其他部門的產品功效聲明證明中獲得了靈感。但是，其他類別產品的現有功效聲明論證程序不能以復制/黏貼的方式自動應用于生物刺激劑，原因有：⑴ 現有生物刺激劑產品(包括微生物和非微生物產品)具有多樣性以及隨之而有的廣泛的功效聲明；⑵ 生物刺激劑的功效受多種環境因素的影響；⑶ 生物刺激劑成分之間的相互作用，以及生物刺激劑本身與其他系統因素(如天氣、土壤微生物群、土壤類型、作物品種等)之間的相互作用都對其功效有影響。

為了促進提供高質量數據支持生物刺激劑的功效聲明(無論是為了投放市場還是商業用途)，EBIC與主要利益攸關方共同制定指導方針，匯編生物刺激劑的可靠數據，以便獲得一致和可靠的結果。

歐洲生物刺激劑工業理事會已經確定有必要制定指導方針，以滿足2 個層面的要求：⑴ 生成支持生物刺激劑功效聲明的數據；⑵ 使用數據支持將生物刺激劑投放歐盟市場和/或支持商業產品功效聲明。

那么需要多少數據來支持產品功效聲明呢?這取決于功效聲明的作用多少。功效聲明范圍越窄，所需的數據就越少。考慮到產品效果、作物或作物分組和生長條件的多樣性，制造商需要靈活設計適應特定農藝狀況的試驗研究。此外，應該認識到，當涉及到提高營養物質有效性的產品(特別是微生物)時，土壤類型和條件可能比作物類型本身更重要。因此，需要靈活的試驗設計來適應這種情況。

產品功效聲明的理由應集中在歐盟的生物刺激劑定義上。為了將產品投放歐洲市場，所有功效聲明均應證明與歐盟肥料法規(歐洲委員會，2016 年；歐盟理事會，2018 年)之生物刺激劑定義中的4 種功效聲明之一：提高養分利用效率、對非生物脅迫的耐受性、作物品質特征或土壤和根際被限制養分的可獲得性。

由于每一類功效聲明都相當寬泛，表4 給出了各類功效聲明的更精確描述，以使每一類功效具體化并便于執行。

表4 生物刺激劑的功效聲明類別及子類

此外，這些影響通常會轉化為對農民有價值的建議。例如提高產量(這在歐盟肥料法規中沒有明確提到，但可能是使用任何生物刺激劑產品的結果)和提高作物質量(這是生物刺激劑的作用)。雖然產量收益可以追溯到法規中所定義的生物刺激劑功效聲明中的一種，但EBIC 已將其列為單獨一類功效聲明，以確保以恰當的術語描述并顯示其功效。

2.2 可支持功效聲明的信息類型

各種類型的數據和經驗證據可以支持生物刺激劑的功效聲明。可以從已發表的文獻和現有數據開始，然后根據需要再使用來自控制條件和田間試驗的新實驗數據來補充這些信息是有意義的。

在控制條件下(溫室、生長室、表型等)從歐盟以外產生的數據應該是允許的，如果測試的氣候條件可以適用于歐盟內部，而且：⑴ 如果它來自制造商自己的GEP/GLP-認證的設施；⑵ 如果產生數據的獨立研究合作伙伴(合同設施、大學等)被認為是有信譽的；⑶ 如果制造商能夠證明所獲得的方法和數據的質量與GEP/GLP-認證的設施所能達到的質量基本相當。

2.2.1 使用已發表的文獻和現有數據

同行評議的科學文獻可以支持生物刺激劑功效聲明。微生物的生物學文獻可以用來描述產品的作用方式，或為支持所提出的功效聲明而進行的任何已發表的相關論文中描述的初步研究等都可以采用。質量可接受的科學文獻可用于支持功效聲明。文獻質量可以根據Klimisch 等人(1997)描述的毒理學和生態毒理學試驗數據質量系統評估方法進行評估，并確定是否可為歐盟化學立法(REACH)的數據要求所接受。需要注意的是，產品內部物質組合起來可能產生各種協同效應或出現的新效應，此時僅靠文獻本身就不太可能充分證明這種功效聲明。

現有的科學信息和現有的田間試驗數據應按照歐洲化學品管理局(ECHA)為實施歐盟化學品法規(REACH)而定義的相關性、可靠性和充分性標準進行評估后方可采用(歐洲化學品管理局2011)。

2.2.2 試驗數據

生物刺激劑的功效聲明可以由受控條件下(實驗室、溫室、生長室、表型等)和/或田間(田間試驗)條件下產生的試驗數據支持。來自精心設計的小型實驗室和生長室研究的額外數據往往構成所提供的功效聲明理由的重要組成部分。如果使用田間數據，至少必須包括一些歐盟境內的試驗數據。如果來自歐盟以外的田間數據都是在與歐盟相似的地理氣候條件下生成的(并且與產品使用的預期環境相對應)，則可以為歐盟所采納。可以參考現有的“確定地理氣候條件可比性的指南文件(歐洲和地中海植物保護組織，2014)”確定來自歐盟以外的數據是否合乎要求。

田間試驗可提供生物刺激劑在真實條件下作用效果的必要信息。然而，對于某些功效聲明如耐受鹽脅迫或冷脅迫的能力，都很難人工模擬合適的田間脅迫的實際情況。在這種情況下田間試驗的重點將更多地放在刺激劑對作物產量/質量等“整體”效益的影響上。而與刺激劑作用方式有關的功效聲明的具體內容可在受控條件下得到驗證。比如可以證明在受控的溫室或實驗室條件下使用生物刺激劑產品可增加磷素的可獲得性，并向農民證明使用相同的產品可提高產量和/或質量這一總體效益。如果制造商只想要證明某生物刺激劑產品能溶解磷，而不想證明其隨后能提高產量和/或質量，就不需要進行田間試驗。

在考慮了生物刺激劑的積極和消極影響后，其農業凈效益必須足以證明使用刺激劑產品的合理性。某個產品的使用效益必須與該產品設定的使用環境相適應。在某些情況下，可以接受低水平的效益，例如：⑴ 當產品將作為作物綜合管理(ICM)計劃的組成部分使用時，或⑵ 在特殊情況下，如有機農業生產，或在減少養分使用的同時因使用生物刺激劑產品還能保持相同的產量或質量水平的情形。

如果試驗數據表明產品效果出現顯著的不一致，那么就必須對不一致的原因加以解釋。產品使用說明要讓用戶明確在什么條件下能讓產品表現出最佳效果，以及哪些因素會影響產品的有效性。原因不明的產品性能的變化不應阻礙產品投放市場，但在這種情況下產品功效聲明的不確定性應該在產品標簽上說明。透明度對于農民做出明智的選擇至關重要。

3 生物刺激劑試驗/測試的總指導

通用指南統計程序的使用應適用于田間試驗軟件(如ARM)。

3.1 試驗研究計劃

試驗研究計劃應包括以下內容：⑴ 試驗目的；⑵ 統計分析和試驗設計；⑶ 試驗條件；⑷ 田間試驗的設計和布局；⑸ 對照數據；⑹ 刺激劑處理的應用；⑺ 評估方式。以下分別詳述這些內容。

3.1.1 試驗目的

⑴ 試驗的目的和試驗場地的基本信息：應具體規定試驗的目標，包括待驗證的生物刺激劑的功效以及在試驗中納入其他變量(使用劑量、使用條件)；⑵ 試驗是否為評估某種功效聲明或其他目的(發芽試驗、收獲產品的質量、對后續作物的影響等)；⑶ 應提供關于試驗地點的基本信息，包括完整的地址和地理坐標(如果可能)，作物和品種，關于試驗地的任何有用的細節(例如光照和坡度)。

3.1.2 統計分析和試驗設計

將生物刺激劑投放市場絕不應被認為是保證它在所有條件下都有效，因為許多因素可能會影響生物刺激劑的田間表現。還有許多其他因素與生物刺激劑產品有關。這些可能包括：⑴ 提供與作物綜合管理系統和/或有機農業兼容的方法；⑵ 與栽培實踐有更大的兼容性；⑶ 減輕替代生產系統的不良影響(對人類、有益生物、非目標生物、其他作物等)。

在這種情況下，生物刺激劑制造商應確保能夠向用戶提供有關產品性能的準確信息，并就如何最佳使用該產品提供建議，以使其盡可能有效和經常地發揮作用。

考慮到生物刺激劑的作用性質以及它們內在的可變性(從生理和生物敏感性到土壤氣候條件，當地微生物多樣性和作物遺傳特性)，在受控的條件下(溫室或實驗室)與未經處理的對照相比可以將置信水平設置在90% (在受控條件下的最低農藝生產試驗)。

為證明生物刺激劑的功效聲明，至少要在歐盟進行3 次田間試驗。在田間試驗中，與未經處理的小區相比，如果觀察到生物刺激劑表現出經常的“農學上”的積極作用趨勢(不一定具有統計學上的顯著性)，可以認為這足以支撐生物刺激劑的功效聲明。

如果在一個季節內且在不同的地理氣候條件下(與產品銷售和使用地的環境條件和農藝條件相似)進行足夠的試驗證明功效聲明是合理的，那么試驗就不需要經過多個季節的試驗。這些試驗應該在歐盟進行。

試驗設計應該以能區別處理區和未處理區的方式進行。建議有足夠的重復，以確保減少數據的可變性和增加觀察到處理區和未處理區之間經常性差異的機會。

如果生物刺激劑的性能受溫度、土壤類型、作物或其他參數的影響，那么試驗設計、執行和后續用戶建議都應考慮這些因素。

如果試驗設計得當，可以在一次試驗中證明多種功效聲明。

在產量和質量方面，未經處理的小區試驗結果應反映當地生產的正常農藝預期。

研究計劃應詳細說明評估的內容、評估的方式、評估的時間和原因。

建議至少評估農民所關心的某一個可測量指標(如對產量和/或質量的影響)。例如，根結形成是早期的可測量的參數，但它本身不足以確認對作物產量和/或質量的影響。如果在所設計的試驗中沒有評估擬聲明的某種生物刺激作用，那么這個作用就不能在標簽上作為功效聲明。例如，能增加根生長的功效聲明會在試驗中得到證明，但作物產量增加在試驗中沒有量化。此時，標簽可以聲稱“增加了根系生長”，但不能聲稱“能提高產量”，因為產量的增加沒有得到數據證明。

生物刺激劑對植物的藥害應在試驗中加以驗證。如果沒有觀察到植物藥害的證據，那么就沒有必要進行額外的植物藥害試驗。但是，如果有植物藥害的跡象，則需要植物藥害數據。至少，當使用生物刺激劑時，制造商應該提供關于如何將植物藥害降到最低的建議。

來自GEP/GLP 認證設施的數據可以被認為是可靠的，即使這些設施是屬于制造商的(即非第三方機構)。盡管如此，還是希望制造商能證明至少某些研究是由公正和合格的第三方提供的。盡可能多地由獨立和有能力的合作伙伴進行試驗以支持產品功效聲明，這些合作伙伴可以是⑴ 國家研究機構和推廣官員；⑵ 在農業和農學領域發表研究成果的機構(包括但不限于大學、其他高等院校和私人研究機構)和研究人員；⑶ 經認證的私人研究中心(GLP/GEP或GLP/GEP 等效條件)。

3.1.3 試驗條件

應充分說明土地和作物的有關情況，例如：⑴ 對于一年生作物，播種或種植日期、密度、行距；⑵ 對于多年生作物，行的排列和間距或單株種植、修剪或整枝方式、砧木、冠層高度、株寬、年齡、生產過程中的天氣；⑶ 對于溫室作物，可以在栽培箱內、試驗臺上、水培養液中栽培等；⑷ 需要描述作物的栽培方法，如耕作、肥料和灌溉制度，以及任何其他額外的投入；⑸ 應說明作物在進行生物刺激劑處理時是在正常條件下生長還是在有脅迫(如干旱、霜凍、風或其他整體化學處理的影響，和/或其他有害生物如病害和雜草的影響)存在的條件下生長的；⑹ 對于土壤使用的生物刺激劑產品，應至少在試驗的第1 個月每隔2 h 記錄表層土壤在根區層面的溫度；并應描述土壤特征，如砂土、黏土、粉砂土和有機質百分含量，以及pH 等。

3.1.4 田間試驗設計和布局

試驗小區的設計和布局應加以描述，最好附有平面圖，小區的數量、大小和形狀，無論是由小區在地面上的尺寸確定的還是由特定的植物布局確定的都可以。

應指明試驗設計的類型。為未經處理的對照所作的安排應被準確地標出，以及任何其他對照方式的細節。

在保證科學設計的同時，試驗小區應確保完全隨機區組排列，以避免試驗小區之間試驗條件可能帶來的任何干擾(例如在干旱脅迫緩解試驗中，必須將充足供水的試驗帶置于試驗處理的旁邊作為參考)。

在試驗中應保證有足夠的重復，以獲得12 個自由度，這樣就可以證明經處理和未經處理的作物之間是否存在經常的差異。

3.1.5 對照數據

對照數據集可以是來自完全未經處理的小區，也可以來自所謂的“漏驗”組(omission group)。漏驗組與處理組方案相同，只是不用生物刺激劑。

為證明用于“改進營養攝取”這一功效聲明要求設置的對照類型應包括：⑴ 未經任何處理的對照。⑵ 當生物刺激劑產品中含有營養素時，需要設置如下之一作為對照組，選擇1：如果“支持組”提供營養元素，則單獨使用“支持制劑”；選擇2：不含營養元素的生物刺激劑制劑單獨使用。⑶ 當產品功效聲明包括抵抗非生物脅迫時，對照應包括：有脅迫的對照、無脅迫的對照、脅迫水平的表述。

3.1.6 刺激劑處理的應用

應提供有關試驗產品的配方、使用方法、濃度和數量的準確信息。

為證明生物刺激劑功效聲明的正當性，應以達到預期效果所需的最低推薦劑量進行試驗。然而，這對于產品組成主要是環境中自然存在的物質的生物刺激劑產品可能不那么重要，除非添加量顯著超過了現有的自然本底水平。此外，對于某些生物刺激劑(例如微生物生物刺激劑)，最低有效劑量的概念可能更難以在實際中確定，而一個劑量范圍則可能更適合證明相關的功效聲明。在這種情況下，當需要對建議的劑量作出適當解釋時，可能沒有必要提供田間產生的數據。這種解釋應涉及微生物的作用方式和生物學，還可以包括為推薦制劑濃度和/或使用劑量提供基礎的任何初步研究(包括相關已發表的同行評價論文)。

雖然制造商應該總在尋求證明推薦劑量的合理性，但缺乏精確或常規的劑量驗證數據不能成為阻止生物刺激劑投放市場的理由。在此情況下，制造商根據實驗室或田間試驗獲得的有效數據提供證明獲得有益影響所需的最低劑量的信息可能就足夠了。

⑴ 測試和參考產品：應給出試驗(測試和參考)中包含的產品的信息，包括通用名稱或其他指定標準(如果有)，以及每個制劑產品的確切名稱或其他名稱。

⑵ 使用方式：應提供如下信息以確保田間試驗遵循了良好農業規范：①使用的方法和設備；②任何與預期劑量的顯著偏差；③可能影響產品功效聲明的操作條件(例如噴霧壓力、噴嘴類型、噴霧質量和噴霧器的移動速度)；④使用次數；⑤每次使用的日期(包括年份，最好使用日-月-年格式表示使用日期)；⑥每次使用時作物的生長階段(見BBCH 生長階段關鍵詞)；⑦使用劑量(mL/hm2，g/hm2或L/hm2, kg/hm2)和噴霧量(L/hm2)。

⑶ 氣象數據：應記錄下列氣象資料：①試驗員在使用刺激劑當天前后觀察得到的氣象資料可能影響試驗結果。這取決于試驗者的判斷，但不需要提供像使用當天那樣詳細的氣象資料。②必須提供試驗人員在使用生物刺激劑的當天觀察的氣象資料，包括某些標準數據(溫度、濕度、風速)；如果在葉面使用后24 h 內下雨，應予記錄(涉及到產品的耐雨水沖刷性)。

⑷ 試驗期間還應記錄土壤數據。

3.1.7 評估方式

⑴ 評估的類型、時間和頻率。⑵ 每次評估的類型和日期。⑶ 應描述使用的方法。使用的任何評估標準(尺度)都應加以說明。⑷ 對作物的直接影響。應注意每個試驗小區是否存在植物藥害，并準確描述所有藥害癥狀，例如發育周期的變化、顏色變化、壞死、變形、對植物的產量和質量的影響。⑸ 當需要產量和質量數據時，應仔細記錄每一種作物所需的具體參數。

3.2 試驗報告

試驗報告應包括：⑴ 試驗目的；⑵ 供試產品和參考產品清單，包括劑量和使用次數；⑶ 評估方式；⑷ 試驗結果，包括統計分析(如有)。

3.3 進行生物刺激劑田間試驗的作物分組

當進行證明生物刺激劑功效聲明的試驗時，可參考表5 中列出的作物分組建議，選擇需要試驗的作物。歐洲生物刺激劑工業委員會(EBIC)建議的指導方針(表6)，可以幫助制造商確定需要的試驗次數，試驗次數需要視實驗性質而定，并要防止評審當局對試驗的過多要求。盡管已有這樣的指導方針，但是制造商仍然可能需要根據特定的刺激劑功效聲明調整試驗。

表5 為證明生物刺激劑功效聲明的作物分組建議

表6 為證明刺激劑功效聲明所需要的試驗次數

在適當的情況下，可以用適當的科學文獻代替所建議的一個或多個試驗。

4 結 論

一種產品的生物刺激劑作用需要通過其試驗效果來證明，但這不是為了保證產品具有特定水平的效果。在任何情況下，都不能認為投入市場的生物刺激劑產品必須在所有情況下都有效，因為許多因素可能會影響某種生物刺激劑在田間的表現。對證明產品功效聲明的要求應與任務成比例；制造商應該提供足夠可信的數據，但又不能使之成為制造商不必要的負擔。功效聲明范圍越窄，所需的數據就越少。考慮到可能的影響、作物或作物分組和生長條件的多樣性，制造商需要靈活設計適應特定農藝情況的試驗方案。此外，還應認識到，對于目的在于改善營養物質供應的產品(特別是微生物類刺激劑產品)而言，土壤類型和土壤條件在設計試驗時可能比作物類型本身更重要。隨著刺激劑產品向復雜、多組分的方向發展，田間試驗將變得更加重要。要證明刺激劑產品的多重效應，特別是協同效應或新出現的效應時，則對試驗設計有更高的要求。

歐洲標準化委員會(CEN)已經開始研究過程和方法，這些過程和方法將成為一套統一的歐洲標準的基礎，根據歐盟肥料產品新法規來證明生物刺激劑的功效聲明。這項工作包括標準的名稱、生物刺激劑規格、標簽、測試方法、驗證產品功效聲明和安全要求等。

由EBIC 制定并在本文中概述的一般原則可以為CEN 關于功效聲明論證的相關標準的起草提供參考，因為這些原則的提出得益于參與生物刺激劑產品功效聲明測試的專業人士之間的重要討論。