10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑制備及其 對小菜蛾的毒力評價

韋登秀，張成華，黃云霄，胡安龍

(1.貴州大學 農學院，貴陽 550025；2.貴州大學 作物保護研究所，貴陽 550025； 3.山東省農業科學院，濟南 250100；4.畢節市植保植檢站，畢節 551700)

小菜蛾[Plutella xylostella(L.)]屬鱗翅目菜蛾科，是一種世界性遷飛害蟲，分布廣泛，已經成為全球為害十字花科植物的毀滅性害蟲[1]。據統計，小菜蛾危害蔬菜所造成的損失一般為30%～50%，嚴重時可達90%以上，甚至絕收[2]。防治小菜蛾的方法有很多種，但化學防治效果較好[3]。然而，對于大多數農藥，特別是殺蟲劑，只有＜0.1%的施藥量到達并作用于靶標[4]。氯蟲苯甲酰胺(chlorantraniliprole)是目前農業生產中防治小菜蛾的常用藥劑之一。據調查[5]，氯蟲苯甲酰胺的大量、不科學使用，導致小菜蛾、甜菜夜蛾、斜紋夜蛾等害蟲抗藥性日趨嚴重。相關研究表明，2011 年以來，小菜蛾對新型雙酰胺類藥劑氯蟲苯甲酰胺的抗藥性全面爆發，廣東地區抗藥性最高可達1 749.96 倍[6]。時隔一年，Wang 等[7]監測到42 000 倍抗藥性的抗氯蟲苯甲酰胺小菜蛾田間種群。此外，農藥過度施用還會造成對環境的污染及農產品質量安全等。因此，尋找綠色農藥新劑型以降低農藥的殘留危害和提升利用率，成為當前農藥劑型發展的熱點方向[8]。近10 年以納米材料為載體的納米農藥制劑逐漸成為了人們的研究課題。

通過機械破碎，用納米加工手段將農藥活性成分直接加工成納米級粒子；利用納米載體通過吸附、偶聯和包裹等方式裝載農藥，是人們獲得納米農藥新劑型的2 種方式[9-10]。關于納米農藥制劑的研究與應用，國內已有一些報道[11]，但是針對新型殺蟲劑氯蟲苯甲酰胺的納米制劑研究尚未涉及。

基于此，本研究利用普魯蘭酶解法進行脫支處理[12]，切開支鏈淀粉分支點中的α-1,6 糖苷鍵，后用過量的無水乙醇進行沉淀，制成直鏈淀粉納米顆粒并包埋農藥，制備出10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑，并采用浸蟲法測定了97%原藥、35%水分散粒劑、10%納米可濕性粉劑對小菜蛾的室內毒力，旨在為納米淀粉囊材包裹農藥的研發生產及其在小菜蛾化學防控中的應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：JSM-7200F 型掃描電子顯微鏡(SEM) (北京捷歐路科貿有限公司)；GZX-9140MBE 型恒溫培養箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；Protect-1FD/117122004 型超凈工作臺(瑞士梅特勒公司)；XS105DU 型分析天平(瑞士梅特勒公司)；SF818 型離心機(張家港市高宏離心機制造有限公司)；VELP AMI4 型磁力攪拌器(常州維度儀器制造有限公司)；HWS 28 型恒溫水浴鍋(上海達平儀器有限公司)；LGJ-10C/E 型冷凍干燥機(四環福瑞科儀科技發展有限公司)；培養皿(Φ60 mm，上海五一玻璃儀器廠)、養蟲籠等。

藥品和試劑：蠟質玉米淀粉(眾誠食化生物科技)；普魯蘭酶液(寧夏夏威實業集團有限公司)；磷酸緩沖液(諾倫生物有限公司)；99%甲醇(濟南潤豐寶利來工貿有限公司)；97%氯蟲苯甲酰胺原藥(南京紅太陽股份有限公司)；35%氯蟲苯甲酰胺水分散粒劑(山東鄒平農藥有限公司)；10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑(貴州大學農安實驗室)。

1.2 供試昆蟲

供試昆蟲為小菜蛾。蟲卵購自河南濟源科云生物有限公司，將買回的小菜蛾蟲卵放入恒溫培養箱進行孵化，將孵化的1 齡幼蟲移至裝有濾紙的培養皿中進行人工飼料飼養。供試人工飼料是購自河南省濟源白云實業有限公司。

人工飼料飼養法[13]：準備好培養皿、濾紙，將濾紙放入消好毒的培養皿里，把飼料切成正方形小塊后放入培養皿中，最后將剛剛孵化的幼蟲移至培養皿中。1～2 齡時飼料可以適量少些，3～4 齡后飼料需要加量，1～2 齡時2 天更換1 次培養皿，3 齡以上時每天更換1 次。觀察小菜蛾蟲齡達老熟幼蟲后移至干凈的培養皿待其化蛹，完全化蛹后可移至養蟲籠待其羽化。取生長基本一致的2～3 齡幼蟲供生測試驗用。

1.3 試驗方法

1.3.1 納米農藥的制備

1.3.1.1 直鏈淀粉納米顆粒的制備

稱取10 g 淀粉于250 mL 燒杯中，加入100 mL磷酸緩沖液(pH=5.0)，攪拌均勻。于100 ℃水浴加熱成糊狀，將糊化好的淀粉冷卻至60 ℃，加入23 mL (1 mL 酶液+66 mL 無菌水)普魯蘭酶液，攪拌均勻，放入60 ℃水浴鍋中水浴6 h，隨后置于電爐上加熱煮沸8 min 使酶失活，將煮沸后的淀粉液加入50 mL的離心管中，3 000 rpm 離心15 min，除去未脫支的分子，取上清液加入燒杯中，后分兩種方式加入無水乙醇：⑴ 無水乙醇體積是淀粉液的3 倍；⑵ 無水乙醇體積是淀粉液的10 倍；然后，放入4 ℃的冰箱里靜置過夜，第2 天取出上清液，留下沉淀，將沉淀冷凍干燥24 h 后取出，放入研缽里研細，再裝入密封袋中并放入4 ℃冰箱冷藏備用[14]。后用掃描電鏡(SEM)對其進行表征，將制備成功的納米顆粒用于制備10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑。

1.3.1.2 10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑的制備

稱取制備好的蠟質玉米淀粉納米顆粒1 g 于250 mL 錐形瓶中，加入20 mL 去離子水溶解，超聲洗滌器超聲1 h，并放入121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌30 min，取出后置于90 ℃水浴鍋中水浴平衡2 h，使其進一步溶解。稱取97%氯蟲苯甲酰胺原藥0.5 g于燒杯中，加200 mL 酒精溶解完全，隨后將藥液逐滴加入水浴2 h 后的蠟質玉米淀粉溶液中，磁力攪拌器攪拌6 h，4 ℃冰箱靜置過夜，取出靜置好的藥液除去上清液，然后分別采用2 種方法進行改造。第1 種是冷凍干燥法，將沉淀預凍過夜，次日將預凍好的材料放置于冷凍干燥機中冷凍干燥24 h，取出充分研磨后裝入密封袋，放入4 ℃冰箱冷藏待用。第2 種是烘干法，直接將靜置好的藥液倒入培養皿中，于70 ℃溫度下烘干6 h，刮下藥粉，充分研磨后裝入密封袋，放入4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.2 10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑的表征

稱取1 mg 的樣品溶入10 mL 蒸餾水中，超聲5 min 使其分散均勻后，用濾膜過濾后備用；將過濾液滴于帶有碳支持膜的銅網上，用液氮速凍后再將銅網冷凍干燥，將干燥后的樣品放入掃描電子顯微鏡(SEM)系統中，抽真空5 min，在20 kV 加速電壓下觀察，統計并記錄樣品粒徑大小。

1.3.3 10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑質量指標測定

10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑技術指標：⑴ 水分測定：采用卡爾費休水分測定儀進行測定。⑵ 熱貯穩定性測定：參照GB/T19136—2003 農藥熱貯穩定性測定方法進行，熱貯試驗為2 周，溫度為(54±2) ℃。⑶ pH 測定：酸度用微機型精密pH計法進行測定。⑷ 懸浮率測定：參照GB/T14825—2006《農藥懸浮率測定方法》進行測定。⑸ 濕潤性測定：按GB/T5451—2001《農藥可濕性粉劑濕潤性測定方法》進行測定。

1.3.4 室內毒力測定

室內毒力采用浸蟲法測定[15]。根據參照預試驗結果，每種農藥設置5個濃度梯度：0、1、2、4、8、16 mg/L。每個濃度處理供試蟲源15 頭，設置重復3次，以清水作為對照處理。將生長狀況一致的2～3齡幼蟲放置于干凈的培養皿中，將試蟲放入塑料網罩中，于如上濃度藥液中浸漬5 s 后取出，放在濾紙上爬行，待其自行晾干后，移至鋪有濾紙并置有飼料的潔凈培養皿中，用保鮮膜封口，用牙簽在保鮮膜上扎小孔。最后將培養皿置于溫度(27±1) ℃，濕度為75%～85%，光照為L∶D=14 h∶10 h 的智能人工氣候箱內，在24 h 和48 h 后分別觀察和記錄試蟲死亡情況，計算死亡率和校正死亡率。判斷試蟲死亡標準為，用毛筆輕觸蟲體，不動者視為死亡。

1.4 數據處理

根據試驗記錄數據，以對照死亡率低于5%視為有效測定，算各處理的死亡率和校正死亡率。計算公式如下：

所有試驗數據用 Microsoft Excel 2019 進行處理，將校正死亡率轉換為機率值后，采用DPS 數據處理系統進行分析，求出每種藥劑的毒力回歸方程、LC50及95%置信限。

2 結果與分析

2.1 直鏈淀粉納米顆粒表征及直徑

由圖1 可知，在SEM 500 nm、1 μm 2 個視野中觀察到，不同處理下的直鏈淀粉納米顆粒大小不一；由表1 可知，當無水乙醇與淀粉液的體積比為3∶1時，粒徑分布范圍廣，粒徑為10～8 000 nm，平均粒徑為186.70 nm；當無水乙醇與淀粉液的體積比為10∶1時，并延長超聲時間為20 min，粒徑范圍在10～76 nm，平均粒徑為52.23 nm，說明制備納米顆粒以無水乙醇和淀粉液的體積比為10∶1 時為最合適。

圖1 直鏈淀粉納米顆粒掃描電鏡(SEM)圖

表1 直鏈淀粉納米顆粒粒徑測定結果

2.2 10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑表征及直徑

由圖2 可知，在SEM 500 nm、1 μm 2 個視野中觀察到，10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑的外貌形態不規則，大多近似球狀。粒徑大小較為均一，粒徑大小為40～85 nm，平均粒徑為64.22 nm。

圖2 10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑SEM 圖

2.3 10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑的質量指標

質量指標檢測結果見表2。可見，制備的制劑外觀為淡黃色，其有效成分含量為10.12%，水分含量為0.92%，粒徑為64.22 nm，pH 為6.8，熱貯穩定性為合格狀態，懸浮率為98.7%，濕潤時間為2.6 min。

表2 10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑的質量指標檢測

2.4 氯蟲苯甲酰胺對小菜蛾的毒力

氯蟲苯甲酰胺對小菜蛾室內毒力測定結果見表3。可見，在設定的5 種濃度下，氯蟲苯甲酰胺97%原藥、35%水分散粒劑、10%納米可濕性粉劑處理后24 h，平均校正死亡率分別是13.64%～81.82%、13.33%～ 77.88%和11.63～83.72%；藥后48 h 時，分別為16.28%～ 97.62%、18.60%～95.35%和19.05%～97.62%，說明10%納米可濕性粉劑藥后24 h 對小菜蛾的平均校正死亡率是最高的；藥后48 h，除16 mg/L 濃度外，35%水分散粒劑對小菜蛾的平均校正死亡率略高于10%納米制劑和97%原藥，但均未達到顯著差異(p＞0.05，p＞0.01)。

表3 氯蟲苯甲酰胺對小菜蛾的致死率

將表3 中氯蟲苯甲酰胺濃度與小菜蛾死亡機率值之間進行線性回歸，結果見表4。可見，10%納米可濕性粉劑藥后24 h 對小菜蛾室內毒力優于97%原藥和市售的35%水分散粒劑。處理后24 h 和48 h 時，3 種氯蟲苯甲酰胺藥劑對小菜蛾的毒性從大到小的順序分別為10%納米可濕性粉劑＞35%水分散粒劑＞97%原藥和35%水分散粒劑＞10%納米可濕性粉劑＞97%原藥。

表4 10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑對小菜蛾的毒力測定結果

3 結論與討論

本研究結果表明，藥后24 h，氯蟲苯甲酰胺10%納米可濕性粉劑對小菜蛾的活性優于97%原藥和35%水分散粒劑。Feng[16]等研究發現利用納米微膠囊包裹的氯蟲苯甲酰胺納米農藥較水分散粒劑具有較強的釋放率，提高了農藥的有效利用效率和生物利用度。此外，Gao[17]等制備了一種智能納米載體，用于傳遞氯蟲苯甲酰胺，對小菜蛾的可持續防治起到一定增強作用。可見，應用納米技術制備微膠囊、載體用于包裹或傳遞農藥，均有利于提高殺蟲活性，為害蟲的高效治理提供了一種有前景的策略。