c-myc與CENPA在結直腸癌表達的相關性及其臨床病理學價值*

陸偉杰,高小姣,史春桃,韓 瑋,程 杰△

(1.江蘇大學附屬昆山醫院普外科 215300；2.江蘇大學附屬昆山醫院病理科 215399；3江蘇省無錫市錫山人民醫院普外科 214000)

結直腸癌已經成為全球發病率第三的惡性腫瘤,嚴重影響這人類的生命健康,因此,發掘新的腫瘤標志物對結直腸癌早期篩查及診療具有重要意義[1-2]。癌基因c-myc定位于染色體8q24,由于該基因的激活可使細胞無限增殖,獲得永生化功能,故其在腫瘤發生和進展中起關鍵作用[3-4]。著絲粒蛋白A(centromere protein A,CENPA)是由位于染色體2p23的CENPA基因所編碼的促癌蛋白,目前研究表明,其異常高表達是導致人類癌癥基因組不穩定性的重要因素,其中包括8q24/Myc區域相關的基因不穩定[5-6]。因此,本研究通過數據庫及臨床樣本,旨在分析c-myc與CENPA在結直腸癌中的相關性及臨床病理學價值。

1 材料與方法

1.1 數據庫分析

利用Oncomine數據庫(https://www.oncomine.org/)和GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)檢索CENPA與c-myc在結直腸癌組織與正常組織中的表達差異,并應用Pearson相關性分析明確二者的相關性。利用PROMO數據庫(http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)預測人類組織中可能作用于CENPA與c-myc啟動子(序列從-2 500到0)的轉錄因子。

1.2 標本來源

篩選出2016年1月至2019年12月于江蘇大學附屬昆山市第一人民醫院行腸癌根治術的86例具有完整的臨床病例資料的標本,標本來源患者平均年齡為(66.05±14.06)歲,其中男42例,女44例。每例標本具有癌組織與癌旁正常組織,且病理結果均經兩名以上病理醫師確認。

1.3 主要試劑

免疫組織化學試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；抗c-myc兔多克隆抗體(ab32072)和抗CENPA兔多克隆抗體(ab45694)購自Abcam公司；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.4 免疫組織化學法(SP)

本實驗采用SP法檢測,c-myc抗體稀釋度為1∶200,CENPA抗體稀釋度為1∶300。通過對石蠟切片脫蠟水化和抗原修復,用免疫組織化學試劑盒試劑A與B依次作用切片,進行封閉；滴加一抗工作液,過夜孵育后再依次使用試劑C與D；經DAB顯色后,復染脫水封片。

1.5 染色評分方法

染色強度評分和陽性細胞計數評分相乘結果記為免疫組織化學染色評分(immunoreactive score,IRS)。按染色強度記分：無色、黃色、棕色、褐色分別記為0、1、2、3分,按陽性細胞所占百分比1%～100%分別記為1～100分。根據c-myc和CENPA的IRS值,將≥100定為陽性,反之為陰性。

1.6 統計學處理

采用SPSS 20.0和Graphpad 6.0軟件進行統計學分析。連續變量采用成組配對t檢驗,組內變量采用配對χ2檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。c-myc與CENPA的相關性采用Pearson相關性分析。

2 結 果

2.1 c-myc與CENPA在結直腸癌與正常組織中的表達相關性

Oncomine數據庫分析可得,c-myc與CENPA在結直腸癌組織中的基因表達水平明顯高于正常組織；不僅如此,共表達分析中發現,二者在結直腸正常組織與結直腸癌組織中的表達呈正相關。

在GEPIA數據庫中,筆者同樣發現,在275例結腸癌組織和92例直腸癌組織中,CENPA與c-myc表達均明顯高于正常組織,且二者在結直腸癌組織中表達呈正相關(R=0.26,P<0.001),見圖1。

A:CENPA在結直腸癌組織與正常結直腸上皮組織中的表達差異；B:c-myc在結直腸癌組織與正常結直腸上皮組織中的表達差異；C:CENPA與c-myc在結直腸癌組織中的表達相關性。

在86例結直腸癌組織及癌旁正常組織的免疫組織化學中可以發現,c-myc與CENPA均位于細胞核內,在胞質與胞外基質中無未見明顯表達(圖2A)；且二者在結直腸癌組織中的表達水平均顯著高于癌旁正常組織(tc-myc=9.103,P<0.001；tCENPA=7.913,P<0.001；圖2B)；相關性分析中同樣發現,兩者在結直腸癌組織中的表達呈正相關(P<0.001,圖2C)。

A:c-myc(左)與CENPA(右)分別在正常結直腸上皮組織和結直腸癌組織中的免疫組織化學染色結果(×400)；B:c-myc(左)與CENPA(右)分別在正常組織與癌組織中免疫組織化學染色評分比較；C:c-myc與CENPA在癌組織中免疫組織化學染色評分的相關性分析。

2.2 c-myc與CENPA表達與結直腸癌臨床病理參數的關系

根據二者在結直腸癌組織中的表達情況,進行分組(≥100為陽性,反之為陰性),c-myc陽性組有37例,陰性組49例；CENPA陽性組40例,陰性組46例。c-myc與淋巴結轉移(P=0.004)和TNM分期(P=0.013)呈正相關,而與年齡、性別、腫瘤大小以及病理分級無關(P>0.05)；CENPA陽性者,則僅與更高的病理分級相關(P=0.027)，見表1。

表1 c-myc與CENPA在結直腸癌中的表達與臨床病理參數的關系

續表1 c-myc與CENPA在結直腸癌中的表達與臨床病理參數的關系

2.3 c-myc與CENPA陽性在結直腸癌臨床病理中的作用

c-myc與CENPA均為陽性患者共25例,c-myc陽性、CENPA陰性有12例,c-myc陰性、CENPA陽性有15,二者均陰性有34例。c-myc與CENPA均為陽性與更高的病理分級(P=0.001)、淋巴結轉移(P=0.012)及更晚的TNM分期(P=0.024)密切相關,而與年齡、性別及腫瘤大小無明顯相關。

表2 結直腸癌中c-myc、CENPA均為陽性與臨床病理參數的關系

續表2 結直腸癌中c-myc、CENPA均為陽性與臨床病理參數的關系

2.4 PROMO數據庫預測作用CENPA與c-myc啟動子的轉錄因子

PROMO數據庫中預測發現,有81個轉錄因子可能作用CENPA啟動子,有80個轉錄因子可能作用c-myc啟動子,其中,有AR、TCF-4、YY1等71個轉錄因子可能共同作用CENPA與c-myc啟動子，見圖3。

圖3 PROMO數據庫預測結果

3 討 論

結直腸癌是源于結直腸腺上皮的惡性腫瘤,其發病主要與生活方式、環境、和飲食結構及遺傳因素有關[7]。在這些因素的綜合作用下,癌基因的異常激活成為惡變的重要因素。一直以來,尋找和挖掘新的生物學指標成為學者們攻克結直腸癌的主要研究方向之一。然而,越來越多的研究發現,單一的生物學指標并不能完全解釋結直腸的臨床病理學參數[8]。因此,多基因的聯合檢測成了早期篩查與預后評估的關鍵。

c-myc作為一種經典的癌基因,參與Akt/mTOR、Wnt/β-Catenin等多個信號通路的調控,促進腫瘤的發生與發展[9-10]。因此,c-myc高表達普遍存在于多種惡性腫瘤中[11-13]。本研究同樣發現,相比于正常組織,c-myc在結直腸癌組織中表達明顯增高,且與淋巴結轉移和較晚的TNM分期密切相關。不僅如此,c-myc又是一種轉錄因子調控多種基因,尤其在腫瘤細胞中上調多種癌基因的表達水平[14]。因此,通過檢測c-myc調控的相關基因的表達,在臨床病理學診斷中或許有一定的輔助作用。

著絲粒結構是染色體結構和功能高度特化的重要組件,參與細胞有絲分裂及增殖過程[15]。CENPA則是著絲粒特異組蛋白,是細胞周期相關的重要指標,該基因的缺失會造成細胞染色體異常分離,進而減緩生長[16]。文獻表明,該基因在多種癌組織中的表達明顯升高,提示其參與腫瘤的發生發展[17]。本研究同樣發現,CENPA高表達于結直腸癌組織,且與病理分級呈正相關；從Oncomine與GEPIA數據庫中可以發現,c-myc與CENPA在結直腸癌組織中的表達存在正相關關系。這一正相關關系在本研究收集的86例結直腸癌病例中也得以證實。另外,二者均表達于細胞核內,為此,本研究又將病例分為兩組,即c-myc、CENPA均為陽性組與其他表達組,從而發現,二者均為陽性組與病理分級、淋巴結轉移及TNM分期呈正相關?？梢?二者聯合在臨床病理學參數的評估價值優于任意一種。然而,c-myc與CENPA之間的相關調控機制,還需開展深入的基礎實驗來確認。PROMO數據庫預測出有AR、TCF-4、YY1等71個轉錄因子可能共同作用CENPA與c-myc啟動子。這些轉錄因子在結直腸癌發生發展中具有促進作用,尤其是TCF-4,在Wnt/β-catenin信號異常激活中起到重要作用[18]。而c-myc又能通過多種途徑形成正反饋環路,進一步刺激自身表達上調[19]。根據PROMO數據庫預測和相關性分析結果,筆者推測,很可能就是因為c-myc的這種反饋調控促進CENPA的表達上調,并使二者表達呈正相關。但是,這些推論還需后續體內外實驗的驗證。

綜上所述,c-myc與CENPA在結直腸癌組織中表達均明顯升高,且呈正相關；c-myc與淋巴結轉移和TNM分期呈正相關,而CENPA僅與病理分級呈正相關；二者均為陽性與更高級的病理分級、淋巴結轉移及更晚的TNM分期密切相關。c-myc與CENPA的啟動子可能同時都受到AR、TCF-4、YY1等71個轉錄因子的調控作用。