BAP1基因在皮膚惡性黑色素瘤臨床預(yù)后中的作用*

宋毓平，李 瑞，龔丹妮，曹 晨，杜小芳，靳 平，田 訓(xùn)，肖艷萍△

(1.湖北省武漢市東湖醫(yī)院皮膚科，武漢 430074;2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430014)

皮膚惡性黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma，CMM)是死亡率最高的一種皮膚惡性腫瘤，每年全球新發(fā)病例超過28萬人，死亡病例達(dá)到6萬人[1]。手術(shù)治療目前仍是CMM的主要治療手段[2]，由于對黑色素瘤的深入研究及生物技術(shù)的不斷進(jìn)展，近幾年來CMM的非手術(shù)治療也取得極大進(jìn)步，有效改善了CMM的預(yù)后，但進(jìn)一步提高CMM的預(yù)后仍然面臨著挑戰(zhàn)。BAP1與非小細(xì)胞肺癌[3]、腎透明細(xì)胞癌[4]、惡性胸膜間皮瘤[5]患者的臨床特征和預(yù)后具有相關(guān)性,但BAP1 在CMM中的表達(dá)及與臨床特征及預(yù)后的關(guān)系仍需要進(jìn)一步確認(rèn)。本研究旨在運用癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)、GEO(Gene Expression Omnibus)等公共數(shù)據(jù)集探討B(tài)AP1 mRNA在CMM中的表達(dá)及與臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，為靶向治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 GEO數(shù)據(jù)集分析

從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載CMM樣本數(shù)據(jù)(GDS1375)進(jìn)行分析。

1.2 BAP1在不同皮膚組織中蛋白水平的表達(dá)檢測

選取2015 年1月至2018年12月于本院治療的CMM患者樣本共26例、皮膚痣20例進(jìn)行免疫組化染色。將CMM和皮膚痣的石蠟切片進(jìn)行脫蠟、梯度酒精脫水、抗原修復(fù)。洗滌后37 ℃下山羊血清封閉10 min。將Anti-BAP1兔多克隆抗體按1∶100進(jìn)行稀釋，4 ℃下一抗孵育過夜。PBS洗滌后在37 ℃下用生物素標(biāo)記的二抗下孵育1 h。對切片用蘇木精復(fù)染后按染色強弱進(jìn)行評分：不顯色或顯色不清0分，淺黃色1分，棕黃色2分，深褐色3分。

1.3 SurExpression數(shù)據(jù)庫分析[6]

應(yīng)用SurExpression數(shù)據(jù)庫對皮膚黑色素瘤數(shù)據(jù)集(SKCM-TCGA Skin Cutaneous Melanoma July 2016)中包含mRNA表達(dá)和臨床資料的336例皮膚黑色素瘤患者信息進(jìn)行生存分析，得到相關(guān)基因相應(yīng)表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系。

1.4 GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析

在線應(yīng)用北京大學(xué)開發(fā)研究的GEPIA2數(shù)據(jù)庫中選取 SKCM-TCGA數(shù)據(jù)庫，包含458例CMM數(shù)據(jù)集，患者特征見表1。以BAP1和皮膚黑色素為篩選條件，在Survival界面選擇分析BAP1表達(dá)水平與CMM生存期的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

運用GraphPad Prism (V5.01)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，生存分析運用Kaplan-Meire和log-rank檢驗法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BAP1在CMM組織的表達(dá)水平

通過分析GDS1375數(shù)據(jù)集中7例正常皮膚組織、18例良性痣、45例惡性黑色素瘤組織中BAP1 mRNA水平(圖1 A)，發(fā)現(xiàn)在CMM中BAP1 mRNA水平要明顯高于正常皮膚組織及良性痣組織。進(jìn)一步在20例皮膚痣、26例CMM石蠟切片中進(jìn)行免疫組化染色檢測BAP1蛋白水平(圖1B)，CMM組織中BAP1蛋白水平顯著高于良性組(圖1C)。

A:BAP1在不同皮膚組織中的轉(zhuǎn)錄水平；B:不同皮膚組織免疫組化染色;C：BAP1 在不同皮膚組織中的蛋白水平比較。

2.2 SurExpression在線分析BAP1 mRNA水平與CMM患者的預(yù)后關(guān)系

低風(fēng)險組BAP1 mRNA水平明顯低于高風(fēng)險組，生存分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)高水平的BAP1 mRNA患者具有較差的總體生存率(overall survival，OS)，見圖2。

A：不同預(yù)后風(fēng)險患者中的BAP1 mRNA水平比較；B：BAP1 mRNA與CMM預(yù)后之間的關(guān)系。

2.3 GEPIA2在線分析BAP1 mRNA水平與CMM預(yù)后之間的風(fēng)險關(guān)系

低風(fēng)險組BAP1 mRNA水平明顯低于高風(fēng)險組(圖3A)。 生存分析結(jié)果顯示BAP1 mRNA水平低的患者OS明顯高于BAP1 mRNA水平高的患者(圖3B)。

表1 SKCM-TCGA數(shù)據(jù)集患者特征(n=458)

A:不同風(fēng)險患者中的BAP1 mRNA水平比較；B：BAP1 mRNA與CMM預(yù)后之間的關(guān)系。

3 討 論

目前對CMM的治療取得了很大進(jìn)展，除外手術(shù)治療外，靶向治療、免疫治療等在臨床試驗中都顯示出了一定的治療效果，包括MEK抑制劑[7]、BRAF抑制劑[8]、PD-L1[9]等。由于CMM預(yù)后極差，早期易發(fā)生血行及淋巴轉(zhuǎn)移，腫瘤轉(zhuǎn)移患者的治療效果并不理想，5年生存率只有14%[10]，CMM的治療仍然面臨挑戰(zhàn)。CMM預(yù)后相關(guān)因素的研究對患者治療方案的選擇具有重大指導(dǎo)意義。有研究提示SOX 蛋白有助于CMM診斷及判斷預(yù)后[11]，還有研究發(fā)現(xiàn)血清miRNA可以作為CMM特異性預(yù)后評估標(biāo)志物[12]，但患者例數(shù)有限，無法評估其敏感性及特異性。

人類BAP1基因是由729個氨基酸組成的一種去泛素化酶，定位于第3 號染色體，具有泛素羧基末端水解酶(ubiquitin carboxyl hydrolase，UCH)活性，參與腫瘤細(xì)胞的周期調(diào)控，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。前期大部分研究發(fā)現(xiàn)BAP1表現(xiàn)為腫瘤抑制因子，發(fā)揮腫瘤抑制功能。隨著對其研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)BAP1可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子KLF5 的泛素修飾促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展[13]。AHMET等在348例高級別尿路上皮癌中的研究發(fā)現(xiàn)，BAP1低表達(dá)患者預(yù)后較好。也有研究者通過免疫組化染色在123例胸膜間皮瘤患者的研究中發(fā)現(xiàn)BAP1 蛋白表達(dá)越高，患者預(yù)后越差[5]。本研究在GEO數(shù)據(jù)庫中分析發(fā)現(xiàn)相對正常皮膚組織和良性痣組織，CMM組織中的BAP1 mRNA水平明顯上升。SurExpression數(shù)據(jù)庫中包含130多個數(shù)據(jù)集，超過2萬例臨床病例[12]，進(jìn)一步運用SurExpression數(shù)據(jù)庫分析BAP1 mRNA水平與CMM預(yù)后之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)BAP1 mRNA表達(dá)水平高的CMM患者預(yù)后較差，這提示BAP1與CMM的預(yù)后有著密切的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)BAP1 mRNA在CMM組織中呈高表達(dá)，進(jìn)一步預(yù)后分析顯示了BAP1 mRNA表達(dá)水平低的CMM患者預(yù)后顯著優(yōu)于表達(dá)高的患者，提示BAP1 高表達(dá)可能是促進(jìn)CMM病情進(jìn)展及惡化的重要途徑之一。這些研究為進(jìn)一步探討B(tài)AP1與CMM的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，并提示CMM有可能成為靶向治療的位點，為CMM的靶向治療提供新思路。