仿生合成酶-抗體-磷酸氫鈣雜化納米材料應用于ELISA 檢測Bt 蛋白Cry1Ab

葉染楓

（華中農業大學理學院 湖北 武漢 430070）

0 引言

蘇云金桿菌（Bacillus,thuringiensis,Bt）產生的蛋白質，即Bt蛋白，是世界上應用最廣泛的微生物殺蟲劑之一[1]。與此同時，轉Bt蛋白基因相關產品的安全性評價也受到廣泛關注[2-3]，所以建立一套針對Bt蛋白的檢測方法是極其必要的。目前檢測Bt蛋白的方法主要包括兩類，一類是基于核酸類的檢測方法，如聚合酶鏈式反應[4]、基因芯片[5]等，此類方法一般需要專業的儀器和設備操作過程相對復雜、不太適用于現場大規模的快速檢測。另一類是基于蛋白類的檢測方法，如酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和蛋白質印跡[6-8]，其中ELISA 由于操作相對簡單，適合大批量樣品的檢測。但環境中殘留的Bt蛋白含量一般較低[9-10]，傳統的ELISA 方法中，由于結合于分析物上的酶分子數量有限，往往不能滿足其靈敏度的檢測要求[11]。

納米材料由于其超高的比表面積，使得它適合用于固載大量酶分子來實現信號放大[12-13]。如zhang 等[14]將多壁碳納米管作為載體，固載了大量的辣根過氧化物酶（HRP）和一定量的抗體，并結合ELISA 方法來檢測共濟失調毛細血管擴張突變蛋白，檢出限為0.2 fg/mL。Ambrosi 等[15]用納米金作為載體，固載了大量帶有HRP 酶標記的抗體，并應用于ELISA 方法檢測乳腺癌腫瘤標志物CA15-3，靈敏度可達0.012 OD·mL/U。雖然一般的納米材料都能夠進行大量酶分子的固定，但是酶的固定一般都需要在納米材料的合成完成之后才能進行[16]。也就是說，納米材料的合成與酶的固定是分步進行的，這給操作增加了復雜性。

本研究利用仿生合成法，合成了一種辣根過氧化物酶-抗體-磷酸氫鈣的有機-無機雜化納米材料（HAC）。該方法不僅能讓納米材料合成與酶和抗體的固定，同時且一步完成，而且沒有苛刻的反應條件和繁瑣的純化步驟，合成過程綠色溫和，無需任何有害的化學試劑，讓材料合成與酶和抗體的固定一體化。將HAC 納米材料應用于ELISA方法，可以高效檢測Bt蛋白Cry1Ab。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

辣根過氧化酶（HRP）購自美國sigma 公司；氯化鈣、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；Cry1Ab 蛋白及其抗體購自佑隆生物有限公司。

1.2 HAC 納米材料合成與表征

在離心管中依次加入0.2 M 磷酸-氫鈉溶液15 μL、0.2 M磷酸二氫鈉溶液15 μL、 Cry1Ab多克隆抗體0.02 mg、HRP 0.18 mg 以及超純水950 μL，混勻后，再加入0.2 M 氯化鈣溶液20 μL，混勻后室溫靜置6 h。將離心管內沉淀物進行離心分離并用超水洗滌3 次。所純化的產物溶解在PBS 溶液中。用掃描電子顯微鏡（型號JSM-6390LV，日本NTC 公司）、透射電子顯微鏡（型號：Philips CM200 UT，荷蘭飛利浦公司）、X 射線衍射儀（型號：D8 Advance，德國布魯克公司）對冷凍干燥后的HAC 納米材料進行表征。

1.3 HAC 納米材料應用于ELISA 檢測Bt 蛋白Cry1Ab

1.3.1 條件優化

（1）抗體和HRP 的總用量和投料比?？疾旌铣蒆AC納米材料所需Cry1Ab 抗體和HRP 的總用量為0.1、0.2、0.3 mg，抗體和HRP 的量的比例范圍為1 ∶3、1 ∶5、1 ∶7、1 ∶9、1 ∶11，在不同總用量和比例范圍下分別合成HAC 材料，將合成后HAC 納米材料分別應用于ELISA檢測Bt蛋白Cry1Ab，測量其吸光度值，吸光度值最大的位置所對應的抗體和HRP 的總用量以及投料比即為最佳合成HAC 納米材料的條件。

（2）HAC 納米材料稀釋倍數。選取不同的HAC 納米材料的稀釋倍數，依次為5、10、15、20、30 倍。在這些稀釋倍數下分別應用于ELISA 檢測Bt蛋白Cry1Ab，測量其吸光度值，在吸光度值最大的位置對應的稀釋倍數即為HAC 納米材料的最佳稀釋倍數。

1.3.2 檢測方法

（1）將Cry1Ab 單克隆抗體（1 μg/mL）加入酶標板中，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h，用PBS 洗板3 次。

（2）加入1%牛血清蛋白BSA，每孔300 μL，在37 ℃下孵育30 min，用PBS 洗板3 次。

（3）加入不同濃度的Cry1Ab 蛋白，每孔100 μL，在37 ℃下孵育40 min，用PBS 洗板3 次。

（4）將HAC 納米材料溶液稀釋至合適倍數后，每孔加入100 μL，在37 ℃下孵育20 min，用PBS 洗板3 次后，加入底物顯色劑TMB 溶液，室溫避光反應15min。

（5）加入硫酸終止液，每孔100 μL，用酶標儀（型號：M3，美谷分子儀器上海有限公司）在波長450 nm 處檢測每個孔的吸光度。根據檢測結果，繪制吸光度值與Cry1Ab蛋白濃度之間的標準曲線，根據origin 軟件和3σ 法則分別計算出其線性范圍和靈敏度。

2 結果與討論

2.1 HAC 納米材料表征

如圖1 所示，HAC 納米材料用掃描電鏡和透射電鏡表征其大小和形貌，結果顯示所合成的HAC 納米材料的大小在2 μm 左右，形狀呈花狀。用X 射線衍射儀分析了HAC 納米材料晶型，結果顯示HAC 納米材料的峰位置與CaHPO4·2H2O 的特征峰所對應，表明該材料的無機成分為CaHPO4·2H2O。

2.2 條件優化（投料比）

如圖2（a）所示，抗體和HRP 的總量分別為0.1 mg、0.2 mg 和0.3 mg 的條件下，隨著抗體和HRP 的投料比值的減小，對應檢測吸光度逐漸增加。在抗體和HRP 總量為0.2 mg、投料比為1 ∶9 時，吸光度達到了最大值，說明該條件下所合成的HAC 納米材料的檢測效果最佳。如圖2b 所示，當材料稀釋倍數5 ～20 倍時，檢測信號隨之增大，材料稀釋倍數增至20 倍時，吸光度達到了最大值，檢測效果最佳。所以HAC 納米材料的最佳稀釋倍數是20 倍。

2.3 檢測Bt 蛋白Cry1Ab

2.3.1 線性范圍和靈敏度

檢測方法基于傳統的雙抗夾心ELISA 方法，將HAC 納米材料替換原來的酶標抗體用于檢測Bt蛋白Cry1Ab。配制不同濃度的Cry1Ab 蛋白標準溶液0.1、0.2、1、2、5、10 ng/mL，用于建立標準曲線。如圖3 所示，該方法的線性范圍是0.1 ～10 ng/mL（線性方程為：Y= 0.04X ＋0.143 69，相關系數R=0.995），根據3σ 法則計算出檢出限為0.021 ng/mL。

2.3.2 特異性分析

選擇Cp4-EPSPS 蛋白、CryIe 蛋白、BSA 蛋白作為干擾物來驗證所建立方法的特異性。如圖4 所示，只有當樣品中存在Cry1Ab 蛋白時，才會有較強的吸光度信號，其他非檢測目標物的信號強度與空白樣品強度類似，說明該方法具有良好的特異性。同時HRP-NP 和Ab-NP 分別代表單個固定HRP 或者Cry1Ab 抗體的HAC 材料，其信號強度也與空白樣品類似，結果表明HRP 和抗體是同時固定在HAC 材料上的。

2.3.3 加標回收實驗

為了驗證該方法的準確性和可行性。選擇3 個不同的加標濃度8.0、5.0、1.5 ng/mL，添加至自來水樣品中進行加標回收實驗，結果見表1，在自來水中，Cry1Ab 蛋白的加標回收率在92.0%～101.8%之間，表明此方法對于Cry1Ab 蛋白的檢測具有較高的準確性。

表1 自來水中Cry1Ab 蛋白的加標回收率

3 結論

本文通過仿生合成法，一步綠色合成了HAC 納米材料，所制備的HAC 納米材料大小在2 μm 左右，形狀呈花狀。本研究對合成HAC 納米材料的抗體與酶之間的投料比以及HAC 納米材料的稀釋倍數進行了優化實驗，確定了最佳抗體和辣根過氧化物酶的總用量為0.2 mg，最佳投料比為1 ∶9。HAC 納米材料的最佳稀釋倍數是20 倍。本研究成功將HAC 納米材料應用于ELISA 檢測Bt蛋白Cry1Ab，所建立的方法線性范圍為0.1 ～10 ng/mL，檢出限為0.021 ng/mL，并具有良好的選擇性、準確性。本研究中所設計的基于磷酸氫鈣的有機-無機雜化納米材料除了可應用在生物分析外，還有望應用在環境科學、生物醫學以及催化等相關領域。