基于自相位調制光譜選擇驅動的無標記自發熒光多倍頻顯微鏡系統*

王曉英 邢宇婷 陳潤植 賈雪琦 吳繼華 江進 李連勇 常國慶?

1) (戰略支援部隊特色醫學中心,消化科,北京 100101)

2) (中國科學院物理研究所,光物理重點實驗室,北京 100190)

3) (戰略支援部隊特色醫學中心,病理科,北京 100101)

由飛秒激光驅動的非線性光學顯微鏡技術在醫學組織成像中具有很多獨特的優勢,包括多種成像模態、高對比度、高分辨率和無標記的深層光學切片能力等.由于缺乏波長可靈活調諧的飛秒激發光源,導致在多模態成像的同時難以兼顧每種模態的對比度,從而制約了非線性光學顯微鏡在醫學診斷中的廣泛應用.本文采用基于自相位調制光譜選擇的光纖激光光源,獲得了中心波長在990—1110 nm 范圍內可調諧的高能量飛秒脈沖,并用于驅動非線性光學顯微鏡.采用990 nm 的飛秒脈沖,通過雙光子激發熒光和二倍頻對胃組織成像,進一步結合圖像拼接技術成功獲得了胃組織的雙模態大視場圖像;利用1110 nm 的飛秒脈沖,實現了無標記自發熒光多倍頻顯微鏡技術,同時高效激發了胃組織的雙光子激發熒光、三光子激發熒光、二倍頻和三倍頻信號,獲得了胃組織的多模態圖像.

1 引言

非線性光學顯微成像具有亞微米水平的光學分辨率和光切片的能力,已經成為重要的生物醫學組織成像手段[1].非線性光學顯微成像通過超短脈沖與生物組織之間相互作用可以實現多種非線性無標記成像過程,包括雙光子激發熒光(two-photon excitation fluorescence,2PEF)、三光子激發熒光 (three-photon excitation fluorescence,3PEF)[2-13]、二倍頻(second-harmonic generation,SHG)[13-20]、三倍頻(third-harmonic generation,THG)[12,13,15-17,19,20]、相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering,CARS)[21-23]和受激拉曼散射(stimulated Raman scattering,SRS)[24,25].SHG 過程對有序的非中心對稱分子結構具有高度特異性,因此可為某些細胞和組織成分(如膠原蛋白、微管和肌球蛋白)提供清晰的成像對比度[13-20].THG 源于光學不均勻性,對組織邊界的折射率變化特別敏感,適合對透明物質的界面和細胞等細微結構的輪廓成像[13,15-17,19,20].多光子激發熒光通過獲取生物樣品的各種內源性物質的自發熒光實現成像,這些內源性物質包括視黃醇、輔酶、維生素D、黑色素、彈性蛋白和膠原蛋白等,其中通過收集還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)以及黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)這兩種內源性物質的細胞質自發熒光,可以在圖像中分辨出細胞[2-9,13].基于分子振動的CARS和SRS 成像在獲取圖像的同時還可以識別不同的分子結構[21-25].

在無標記成像中,利用上述多種非線性成像過程實現多模態成像有兩種方案.一種是采用不同的激發條件依次實現多種非線性成像過程[26-28].由于該種方案需要變換激發條件,所以很難實現快速成像;并且激光長時間聚焦到一個位置會增加樣品光損壞的風險;另外在變換激發條件時樣品的移動導致多個模態的圖像無法完美重疊而產生運動偽影.另一種方案是以單個激發配合多個檢測通道,在單次激發條件下同時實現多種非線性成像過程[13,29-32].該方案雖然能避免出現運動偽影和光損傷,但是由于無法對每個信號獨立優化,所以難以高效激發多個非線性成像過程.為了解決該問題,必須選擇波長合適的超快驅動激光,不僅保證能夠同時激發多個非線性成像過程,而且確保這些非線性過程所產生的光學信號能夠被高效檢測,從而實現快速成像.超快光纖激光由于結構簡單、光束質量高、能適應相對惡劣的工作環境等優點被廣泛應用于驅動非線性光學顯微鏡[33].最常用的光纖超快激光器是摻鐿光纖激光器和摻鉺光纖激光器,其脈沖中心波長分別在1.03 μm 和1.55 μm 附近.受限于增益帶寬,這兩種光纖激光所產生的飛秒脈沖都不能在大范圍內波長調諧,大大限制了在非線性顯微成像中的應用.為了解決該難題,人們發展了多種基于非線性光纖光學技術的波長轉換手段以產生波長可以大范圍內調諧的飛秒脈沖,用以優化無標記的非線性顯微成像過程.傳統的非線性波長轉換技術包括孤子自頻移[34-36]、色散波產生[37-40]、超連續譜[41]和四波混頻[42],但這些方式的能量可擴展性差而且轉換效率較低.

為解決這些問題,提出了一種新的波長轉換方法—基于自相位調制(self-phase modulation,SPM)的光譜選擇技術(self-phase modulation enabled spectral selection,SESS)[43-48].在這種方法中,高能量的窄帶飛秒脈沖在很短(<10 cm)的光纖內傳輸即可獲得足夠的光譜展寬,展寬光譜由一系列相互獨立的光譜旁瓣構成,其中最左側和最右側的旁瓣包含大量的脈沖能量.利用光學濾波器濾出最左/最右的光譜旁瓣,可以獲得波長可大范圍調諧的近變換極限飛秒脈沖.在本文中,首次利用SESS 飛秒光源驅動非線性光學顯微鏡實現胃組織的多模態顯微成像.該光源使用重復頻率為43 MHz 的摻鐿光纖激光器作為前端,利用非線性波長轉換技術產生波長在990 nm、脈沖能量約為7 nJ、脈寬約為84 fs 的脈沖.我們使用該光源驅動非線性光學顯微鏡,通過2PEF 和SHG這兩種成像模態對胃組織進行了成像,并將單張小視場的圖像拼接后獲得了大視場雙模態的胃組織圖像.另外,還獲得了波長在1110 nm、脈沖能量大于10 nJ、脈寬約為48 fs 的脈沖,我們使用該飛秒光源獲得了胃組織的2PEF,3PEF,SHG 和THG的多模態圖像.

2 實驗裝置

2.1 基于SESS 的光纖激光光源

基于SESS 的非線性光學顯微鏡實驗裝置如圖1 所示.摻鐿光纖振蕩器產生重頻43 MHz、中心波長在1040 nm、能量約0.2 nJ 的超短脈沖.該脈沖經過光纖展寬器展寬后,脈沖能量由兩級摻鐿光纖放大器放大到100 nJ 以上,圖2(a)為放大后的光譜.圖2(b)中紅色曲線是壓縮后脈沖的自相關曲線,半高全寬為253 fs,假設該脈沖為雙曲正割型,對應的脈寬則為164 fs.圖2(b)中黑色曲線是放大后光譜對應的變換極限脈沖的自相關曲線,與測量得到的自相關曲線重合,表明獲得了近變換極限脈沖.

圖1 基于SESS 的非線性光學顯微鏡實驗裝置.ISO:隔離器,LD:二極管泵浦激光源,WDM:波分復用器,Amp:光纖放大器,HWP:半波片,PBS:偏振分束器,L:透鏡,LPF:長通濾波器,NLOM:非線性光學顯微鏡Fig.1.Schematic setup of the nonlinear optical microscopy driven by SESS.ISO:isolator,LD:laser diode,WDM:wavelength-division multiplexing,Amp:amplifier,HWP:half-wave plate,PBS:polarization beam splitter,L:lens,LPF:long pass filter,NLOM:nonlinear optical microscopy.

圖2 放大脈沖的光譜和自相關軌跡 (a)光譜;(b)自相關軌跡.紅色曲線:測量得到的自相關軌跡,黑色曲線:通過光譜計算得到的變換極限脈沖的自相關軌跡Fig.2.Spectrum and autocorrelation trace of the amplified pulse:(a) Spectrum;(b) autocorrelation trace.Red curve:measured autocorrelation trace.Black curve:calculated from the transform-limited pulses allowed by the amplified pulse spectrum.

為了實現SESS,將壓縮后的脈沖耦合到5.5 cm長的單模光子晶體光纖中,該光纖的模場直徑為10.3 μm,在1030 nm 處的群速度色散為—30 ps/(nm·km).光纖耦合模塊包括光纖支架(HFV001,Thorlabs)、三軸平移臺(MAX313 D,Thorlabs)和有效焦距為15 mm 的非球面透鏡(C260 TMD-C,Thorlabs).低功率下光纖的耦合效率為72%.如圖3(a)所示,當耦合到光纖里的能量為44 nJ 時,展寬光譜中最左側的光譜旁瓣的峰值波長移至990 nm,使用截止波長在1000 nm 的短通光濾波器(#64337,Edmund Optics)濾出最左側旁瓣,得到的脈沖功率為298 mW,能量為6.9 nJ,轉換效率為16%.濾出來的脈沖經過光柵對壓縮,圖3(b)中紅色曲線是壓縮后脈沖的自相關曲線,半高全寬為129 fs,假設該脈沖為雙曲正割型,對應的脈寬則為84 fs.圖3(b)還顯示了左旁瓣光譜對應的變換極限脈沖的自相關曲線(黑色曲線),與測量得到的自相關曲線幾乎重合,表明我們獲得了近變換極限脈沖.

圖3 當耦合到光纖里的能量為44 nJ 時輸出的展寬光譜以及990 nm 處濾波得到的脈沖光譜和自相關軌跡 (a)展寬光譜;(b)自相關軌跡.紅色曲線:測量得到的自相關軌跡,黑色曲線:通過光譜計算得到的變換極限脈沖的自相關軌跡.插圖:990 nm 處濾波得到的脈沖光譜Fig.3.Spectrum broadening with coupled energy of 44 nJ,spectrum and autocorrelation trace of the filtered pulses at 990 nm:(a) Broadened spectrum;(b) autocorrelation trace.Red curve:measured autocorrelation trace.Black curve:calculated from the transform-limited pulses allowed by the spectrum at 990 nm.Inset:filtered spectrum at 990 nm.

如圖4(a)所示,當耦合到光纖里的脈沖能量為50 nJ 時,展寬光譜中最右側的光譜旁瓣的峰值波長移至1110 nm.我們使用1150 nm 的長通濾波器(#89661,Edmund Optics)濾出最右側的兩個旁瓣,得到的脈沖功率為640 mW,能量為15 nJ,轉換效率為28%.同樣,濾出來的脈沖經過光柵對壓縮,圖4(b)紅色曲線展示了壓縮后脈沖測量得到的自相關曲線,半高全寬為74 fs,假設該脈沖為雙曲正割型,對應的脈寬則為48 fs.同一圖中還展示了計算得到的右旁瓣光譜對應的變換極限脈沖的自相關曲線(黑色曲線),變換極限脈沖的脈寬為44 f s,表明獲得了近變換極限脈沖.

圖4 當耦合到光纖里的能量為50 nJ 時輸出的展寬光譜以及1110 nm 處濾波得到的脈沖光譜和自相關曲線(a)展寬光譜;(b)自相關軌跡.紅色曲線:測量得到的自相關軌跡,黑色曲線:通過光譜計算得到的變換極限脈沖的自相關軌跡,插圖:1110 nm 處濾波得到的脈沖光譜Fig.4.Spectrum broadening with coupled energy of 50 nJ,spectrum and autocorrelation trace of the filtered pulses at 1110 nm:(a) Broadened spectrum; (b) autocorrelation trace.Red curve: measured autocorrelation trace.Black curve:calculated from the transform-limited pulses allowed by the spectrum at 1110 nm.Inset:filtered spectrum at 1110 nm.

進一步,我們驗證了濾波得到的兩個不同波長脈沖的長期穩定性.在沒有任何反饋控制的情況下,4 h 內測量輸出脈沖功率的變化小于3%;在對光纖耦合進行主動調節時,4 h 以上能實現低于1% 的功率改變,從而能保證在成像期間功率改變可忽略不計,不影響成像結果.

2.2 掃描顯微鏡

基于SESS 的飛秒光源出射的光束由8 kHz的共振掃描儀進行掃描,并由水浸物鏡(XLPLN25 XWMP2,NA=1.05,Olympus)聚焦到樣品上,產生非線性信號.雙色鏡(F665-Di02-25×36,Semrock)將激發光束和由物鏡收集的發射信號后向分離.采用三個濾波模塊區分不同的非線性信號,每個濾波模塊包含一個雙色鏡和兩個帶通濾波器.在1110 nm 激發下,檢測2PEF/3PEF/SHG/THG 信號 時,濾波模塊1(#34731,#12152,#12096,Edmund Optics)可區分SHG/THG 信號,濾波模塊2(#34731,#86953,#86949,Edmund Optics)用以區分2PEF/3PEF 信號.在990 nm 激發下,檢測2PEF/SHG 信號時,濾波模塊3(#34739,#86953,#12152,Edmund Optics)能夠區分2PEF/SHG 信號.PMT1 和PMT2(PMT2100,Thorlabs)用來探測信號.在1110 nm 激發下,收集2PEF/3PEF/SHG/THG 信號時,以30 FPS 的速度獲取1248 μm×1248 μm 視場的圖像,每幀 1024×1024像素,每十幀平均一次.在990 nm 激發下,收集2PEF/SHG 信號時,同樣速度獲取400 μm×400 μm 視場的圖像,每十幀平均一次,通過電動平移臺(PLS-XY,Thorlabs)平移樣品獲取多張小視場圖像,用ImageJ軟件進行小視場圖像的拼接.

3 實驗結果

為了證明我們的顯微鏡系統在人體胃組織中進行多模態無標記成像的能力,使用990 nm 脈沖驅動非線性光學顯微鏡對胃組織未染色石蠟切片(厚度10 μm)進行成像(圖5),并且使用1110 nm脈沖對胃組織冰凍切片(厚度50 μm)進行成像(圖6).

3.1 離體人體胃組織的2PEF/SHG 成像

使用中心波長在990 nm 的脈沖對胃組織未染色石蠟切片進行成像,由于顯微鏡系統的衰減,物鏡后的最大激發功率為55 mW,考慮到重頻為43 MHz,對應的脈沖能量約1.3 nJ,最終獲得了視場大小為400 μm×400 μm 的胃組織2PEF/SHG圖像.如圖5 所示,由十張小視場圖像拼接得到的胃組織的2PEF/SHG 圖像顯示了正常胃粘膜主要由胃腺和結締組織的基質組成.細胞質內含有FAD 這種內源性熒光團,細胞核內不含有FAD.在2PEF 圖像中,通過收集FAD 的內源性自發熒光,可以識別出位于基底膜表面的單個上皮細胞核(圖5(a)中的白色箭頭),并且可以輕松檢測到由上皮細胞組成的單個胃腺.膠原蛋白基質是形成粘膜基質的基本框架,SHG 圖像主要顯示膠原蛋白等細胞外基質(圖5(b)中的黃色箭頭).從圖5(c)的2PEF 和SHG 的疊加圖像中可以看到基底膜是圍繞單個腺體的細帶,并且基質中的網狀纖維形成了支持胃腺的細網狀結構.

圖5 離體人體胃組織的2PEF/SHG 圖像 (a) 2PEF 圖像;(b) SHG 圖像;(c) 2PEF 和SHG 的疊加圖像.白色箭頭:上皮細胞;黃色箭頭:膠原蛋白.比例尺:100 μmFig.5.2PEF/SHG images of ex vivo human gastric tissue:(a) 2PEF image;(b) SHG image;(c) merging of 2PEF and SHG images.White arrow:epithelial cells;yellow arrow:collagen.Scale bar:100 μm.

3.2 離體人體胃組織的2PEF/SHG/3PEF/THG 成像

使用中心波長在990 nm 的脈沖對胃組織進行成像,由于激發光波長靠近FAD 熒光團的激發峰,所以僅需要很少的能量就可以高效激發2PEF,同時也可以收集到強的SHG 信號.但想獲得更多模態的生物信息,例如THG 和3PEF 信號,就需要波長更長、能量更高、脈寬更窄的脈沖.You 等[13]發明了無標記自發熒光多倍頻顯微鏡技術(simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy,SLAM),該技術旨在單次激發條件下分辨發射光譜重疊的內源性熒光團,并同時激發倍頻過程.實現該技術需要波長可調諧的飛秒激光驅動源以優化特定的多模態過程.NADH 和FAD 是細胞中參與氧化還原反應的兩個主要輔酶,與能量產生和細胞代謝密切相關.在飛秒激光照射下,通過多光子吸收可以激發NADH 和FAD 的自發熒光,該熒光可以用于監測細胞的代謝活動,進而能非侵入性地監測干細胞分化、癌癥發展和神經退行性疾病等過程.在非線性光學顯微鏡成像過程中,NADH 和FAD 通常在750 nm 和880 nm 處被依次激發[2-9,13],成像速率隨著激發波長的數量降低,而且難以確保成像通道之間圖像的重疊.為了解決該難題,You 等[13]提出使用1110 nm 飛秒脈沖作為激發光,同時實現雙光子激發FAD、三光子激發NADH.實驗中,他們利用光子晶體光纖產生超連續光譜,之后從中濾出中心波長在1110 nm 的飛秒脈沖用來驅動非線性光學顯微鏡,結合多個檢測通道得到了較強的2PEF,3PEF,SHG 和THG的信號,實現了對生物組織中多種成分的同步成像.但是目前該SLAM 系統的驅動光源基于固態超快光源產生超連續譜,并且需要空間光調制器實現濾波和脈沖相位補償,導致整個系統結構復雜且對環境波動十分敏感,限制了SLAM 在生物醫學成像中的應用.相較而言,利用SESS 產生1110 nm飛秒脈沖,方案簡單易行、脈沖能量更高,而且將來有望實現全光纖化.為了驗證SESS 光源可用于驅動SLAM 成像,我們把脈沖波長調諧到1110 nm,濾出兩個光譜旁瓣以獲得更強的能量和更窄的脈寬,對胃組織冰凍切片進行SLAM 成像.由于顯微鏡系統的衰減,物鏡后最大的激發功率為225 mW,重頻為43 MHz,對應的脈沖能量約5.2 nJ,最終獲得了胃組織的2PEF/SHG/3PEF/THG 圖像,視場為1248 μm×1248 μm.如圖6 所示,在2PEF圖像中可以觀察到胃組織中的彈力纖維(圖6(a)中的粉色箭頭),SHG 圖像中顯示出胃組織中的膠原纖維(圖6(b)中的黃色箭頭),在THG/3PEF中可以辨別出一些脂肪細胞(圖6(c)和圖6(d)中的白色箭頭).

圖6 離體人體胃組織的2PEF/SHG/3PEF/THG 圖像 (a) 2PEF 圖像;(b) SHG 圖像;(c) 3PEF 圖像;(d) THG圖像;(e) 2PEF/SHG/3PEF/THG 的疊加圖像.粉色箭 頭:彈力纖維;黃色箭頭:膠原纖維;白色箭頭:脂肪細胞.比例尺:100 μm.Fig.6.2PEF/SHG/3PEF/THG images of ex vivo human gastric tissue:(a) 2PEF image;(b) SHG image;(c) 3PEF image;(d) THG image;(e) merging of 2PEF/SHG/3PEF/THG images.Pink arrow:elastic;yellow arrow:collagen;white arrow:adipocyte.Scale bar:100 μm.

4 結論

我們的光纖超快激光源通過新型波長轉換技術SESS 能提供靈活可變的多種波長用于驅動非線性光學顯微鏡,進而實現多模態成像.其中,990 nm 的飛秒脈沖可以驅動2PEF/SHG 顯微鏡,激發胃組織中內源性熒光團FAD 的雙光子熒光,收集膠原纖維的SHG 信號,實現對胃組織未染色石蠟切片的雙模態成像;1110 nm 的飛秒脈沖可以驅動SLAM,激發胃組織中彈性蛋白的雙光子熒光和脂肪細胞的三光子熒光,收集膠原纖維的SHG信號和一些細微結構輪廓界面的THG 信號,實現對新鮮胃組織冰凍切片的多模態成像.

目 前,光學參量振蕩器(optical parametric oscillator,OPO)結合鈦寶石激光器是非線性光學顯微鏡主要選擇的光源[49],它也可以輸出1110 nm的脈沖驅動SLAM.但是它出射的脈沖重頻高(80 MHz)、脈沖寬(140—400 fs),導致峰值功率低難以高效激發自發熒光和多倍頻信號.You 等[13]提出的基于10 MHz 固態鐿激光器的超連續譜光源,通過脈沖整形器選擇超連續譜中1110±30 nm 波段用于驅動SLAM,峰值功率足夠高效激發2PEF/SHG/3PEF/THG 這四個模態的信號,但它體積龐大、昂貴、結構復雜且對環境波動十分敏感.我們提出的基于SESS 的超快光纖光源相對鈦寶石OPO 光源重頻低(43 MHz)、脈寬窄(48 fs)、峰值功率高,相對基于10 MHz 固態鐿激光器的超連續譜光源結構簡單、運行穩定,更加適合驅動SLAM.

腫瘤細胞和腫瘤微環境中的各種成分之間的相互作用已經成為了解腫瘤細胞如何增殖、侵襲、傳播和轉移的關鍵[50].未來,我們可以通過990 nm脈沖驅動2PEF/SHG 顯微鏡結合圖像拼接技術,對癌變和正常胃組織未染色石蠟切片進行大視場成像,并與福爾馬林固定、石蠟包埋、蘇木精和伊紅染色的標準組織切片進行對比,在無標記的2PEF/SHG 顯微鏡中實現輕松分辨癌變和正常的胃組織,用于快速經濟高效地進行組織學評估,推進胃癌的快速診斷.另外,可以通過1110 nm 脈沖驅動SLAM,收集癌變組織的2PEF/SHG/3PEF/THG 信號.不同的通道可以收集到不同的細胞以及細胞外基質的信號,例如3 PAF 可以觀察到基質細胞、巨噬細胞、脂肪組織中的脂質液泡和呈管狀排列的生物囊泡等;2 PAF 幾乎存在于所有細胞中,僅微弱地存在于腫瘤細胞中;THG 主要出現在腫瘤相關囊泡中,SHG 可以觀察到一些膠原蛋白等.這些成像手段有助于我們了解不同細胞和細胞外基質在正常和癌變組織中的變化,可以闡明不同生物成分在癌癥進展中的復雜作用,并發現可用于癌癥診斷和預后的生物標志物.

非線性光學顯微鏡技術具有無標記、多模態、高分辨率和深層光學切片能力等優勢.本文中,通過對厚度為50 μm 的冰凍切片和厚度為10 μm 的石蠟切片進行成像,驗證該技術的無標記多模態成像能力.在未來的實驗工作中,將利用熒光微球精確測量成像系統的空間分辨率;還將對厚的組織塊進行成像,獲取顯微成像系統在不同聚焦深度情況的成像結果,進一步驗證系統的深層光學切片能力.

總之,我們提出的基于SESS 的超快光纖光源可以輸出990 nm 和1110 nm 的脈沖,實現了胃組織中細胞和細胞外成分的同時成像.進一步,我們的光源還可靈活調節中心波長、脈寬、脈沖能量和平均功率等所有重要的激光參數,從而有望廣泛應用于不同的生物醫學成像場景.