3種不同萃取方法對黑胡椒香氣物質的氣質聯用分析

王玨　鐘壹鳴　孫也喬　胡麗松　伍寶朵　郝朝運　范睿

摘 ?要：為探究不同提取方法對黑胡椒揮發性成分的影響，本研究以黑胡椒為材料，利用頂空固相微萃取法（HS-SPME）、戊烷∶乙醚（1∶1）溶劑萃取法和甲基叔丁基醚（MTBE）溶劑萃取法對黑胡椒中的香氣成分進行提取，結合氣相色譜質譜聯用法（gas chromatography-mass spectrometry）和主成分分析法（PCA）對提取的香氣物質進行分析。3種提取方法共得到6類（烯類、醇類、酚類、烴類、崁類、烯類氧化物）33種物質。戊烷∶乙醚（1∶1）溶劑萃取法、MTBE溶劑萃取法及頂空固相微萃取法分別檢測到25、23、27種揮發性化合物，其中，相對含量較高的化合物均為3-蒈烯、檸檬烯、β-石竹烯、β-蒎烯。2種溶劑萃取法中，戊烷∶乙醚（1∶1）溶劑萃取法檢測到的特有化合物有α-松油烯、α-松油醇、β-金合歡烯;與2種溶劑萃取法相比，頂空固相微萃取法（HS-SPME）檢測到的特有化合物有樟腦、4-萜烯醇、2-（4-甲基苯基）丙-2-醇、橙花醇、香樹烯、β-甜沒藥烯和愈創蘭油烴。結合主成分分析得出，β-蒎烯、3-蒈烯、檸檬烯、β-石竹烯對黑胡椒香氣風味貢獻率較大，其中頂空固相微萃取法（HS-SPME）與2種溶劑萃取法所得成分差異明顯。在溶劑萃取法中，戊烷∶乙醚（1∶1）溶劑萃取法優于MTBE溶劑萃取法。溶劑萃取法與頂空固相微萃取法所得物質在種類與數量上均存在差異。在胡椒香氣物質檢測時，將2種方法相結合可以更大程度保證所得化合物種類的豐富性和全面性。

關鍵詞：黑胡椒;溶劑萃取;頂空固相微萃取;氣質聯用中圖分類號：S573.9??????文獻標識碼：A

The study was aimed to explore the effects of different extraction methods on the volatile components of black pepper. Using black pepper as the material， headspace solid phase microextraction （HS-SPME）， pentane∶diethyl ether （1∶1） solvent extraction and MTBE solvent extraction were used to extract the aroma components in black pepper， and gas chromatography-mass spectrometry combined with principal component analysis （PCA） was used to analyze the extracted aroma substances. A total of 33 substances in 6 categories （alkenes， alcohols， phenols， hydrocarbons， olefins， and olefin oxides） were obtained under the three extraction methods. 25， 23， 27 volatile compounds were respectively detected in the pentane∶diethyl ether （1∶1） solvent extraction method， MTBE solvent extraction method and headspace solid phase microextraction method. The compounds with relatively high content of volatile compounds obtained by the three extraction methods were 3-carene， limonene， β-caryophyllene， and β-pinene. α-terpinene， α-terpineol， β-farnesene were only detected in the pentane∶diethyl ether （1∶1） solvent extraction method. Camphor， 4-terpene alcohol， 2-（4-methylphenyl） propan-2-ol， and nerol， alloaromadendrene， β-Bisabolene and guaiazulene were only found in HS-SPME. Combined with principal component analysis （PCA）， β-pinene， 3-carene， limonene， and β-caryophyllene contributed significantly to the aroma and flavor of black pepper. Among them， the composition of HS-SPME and the two solvent extraction methods were significantly different. In the solvent extraction methods， the pentane∶diethyl ether （1∶1） solvent extraction method was better than the MTBE solvent extraction method， and there were differences in the types and quantities of substances obtained by the solvent extraction method and the headspace solid phase microextraction method. In the detection of pepper aroma substances， the combination of the two methods could ensure the richness and comprehensiveness of the obtained compounds to a greater extent.

black pepper; solvent extraction; headspace solid phase microextraction; gas chromatography-mass spectrometry

： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.020

胡椒（?L）為胡椒科（Piperaceae）胡椒屬（）多年生常綠藤本植物，原產于印度，是世界上重要的香辛料作物，素有“香料之王”和“黑色黃金”的美譽。目前，市面上按照胡椒不同的加工方式可將其分為黑胡椒、白胡椒和青胡椒3種類型。其中，黑胡椒由胡椒果不脫皮直接干燥而成。黑胡椒經常作為香料和調味料應用于食品工業中，因其精油具有良好的防腐和抗氧化作用，黑胡椒也可作為腌制食品的天然防腐劑和抗氧化劑。前人研究發現，胡椒屬資源可檢測到較多種類的化合物，但是對于胡椒屬資源化合物的提取鑒定方法研究相對較少，還需進行深入探索研究。

香氣成分提取技術主要有液-液萃取（LLE）、超臨界流體萃取法（SFE）、頂空-固相微萃取（HS-SPME）和水蒸氣蒸餾法（DDE）等。柳中等采用固相微萃取法（SPME）、水蒸氣蒸餾法（DDE）和同時蒸餾萃取法（SDE）3種方法對海南省黑、白胡椒化學成分進行提取分析，共得96種物質，主要是烯烴類物質;侯冬巖等采用蒸餾萃取法對黑胡椒進行萃取后得到28種化合物，主要成分為萜類化合物。前人對胡椒物質的鑒定方法多為固相萃取、水蒸氣蒸餾和超臨界流體萃取等方法，提取物質主要為萜烯類化合物，目前胡椒香氣成分提取技術正趨于完善和成熟，但其提取過程中受溫度、壓力、時間等因素的影響。現有的提取方法在生產中都具有可行性，但是仍存在一些不足。而胡椒屬植物資源需要通過野外收集，此途徑導致很難獲得大量原材料，其中鑒定評價是胡椒屬植物資源創新利用的根本，因此亟需建立一種快速用于鑒定胡椒游離態物質的新技術。

本研究采用頂空固相微萃取（HS-SPME）、戊烷∶乙醚（1∶1）溶劑萃取和MTBE溶劑萃取3種方法對胡椒樣品揮發性成分進行萃取，利用氣質聯用檢測分析其主要物質組成及含量的一致性與差異性。研究結果將對胡椒物質的提取方法進行優化補充，也為胡椒溶劑萃取提供更為多樣的解決方案。

?材料與方法

?材料

供試黑胡椒由中國熱帶農業科學院香料飲料研究所提供，采摘胡椒種質圃的紅色成熟胡椒果進行熱燙法處理，條件為溫度70℃，時間30 s。熱燙法處理結束后及時進行冷卻，將其放置于旋轉鼓風干燥箱中進行干燥，條件為溫度40℃，時間10 h。

Trace 1300-ISQ氣相色譜-離子阱質譜聯用儀（美國賽默飛世爾公司）;HPG-9240A精密鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

方法

1.2.1 ?戊烷∶乙醚（1∶1）溶劑萃取??精確稱取2.0 g黑胡椒樣品置于液氮中，研磨成粉后置于50?mL離心管中加入10 mL戊烷∶乙醚（∶=1∶1）。置于16℃的搖床中進行輕微振蕩30?min，重復2次。將2次過濾后的上清液混勻并加入無水硫酸鈉進行干燥。經有機相針式濾器（13 mm， 0.22 μm）過濾提取液后抽取0.5～1.0 mL置于1.5?mL棕色萃取瓶中，用于GC-MS檢測揮發性成分。設置3次生物學重復。

1.2.2 ?MTBE溶劑萃取??精確稱取2.0?g黑胡椒樣品置于液氮中，研磨成粉后置于50 mL離心管，加入15?mL甲基叔丁基醚（MTBE）混勻后超聲萃取，時間為1?h，溫度55℃;萃取后通過尼龍膜分離濾渣與濾液，向濾液中加入一定量的無水硫酸鈉進行干燥;利用有機相針式濾器（13 mm， 0.22?μm）過濾提取液后抽取0.5～1.0?mL置于1.5?mL棕色萃取瓶中，用于GC-MS檢測揮發性成分。設置3次生物學重復。

1.2.3 ?頂空固相微萃取??將黑胡椒樣品置于研缽中，研磨后過40目篩，精確稱取2.0 g黑胡椒粉置于20 mL的頂空瓶中備用。設置3次生物學重復。

1.2.4 ?GC-MS分析條件??色譜條件：色譜柱為DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱;載氣為高純氦氣（99.999%），載氣流量0.8 mL/min，分流模式進樣，分流比為10∶1，進樣口溫度230℃，起始柱溫度設置為40℃，維持3?min后以5℃/min的升溫速率直到220℃，維持2 min。

質譜條件：離子源為EI源，電子能量70?eV，離子源溫度150℃，傳輸線溫度250℃，掃描范圍為40～450 amu。

將樣品檢測結束后，利用GC-MS系統譜庫（NIST11）檢索導出結果，通過人工檢索和查閱文獻確定物質種類并計算其百分含量。

?數據處理

利用Excel 2019和Origin 2018軟件對試驗數據進行統計及主成分分析，對黑胡椒在3種方法下所得化合物進行分析。

結果與分析

種萃取方法黑胡椒揮發性成分的分析總離子流色譜圖

根據上述3種萃取方法，分別將戊烷∶乙醚（1∶1）溶劑萃取、MTBE溶劑萃取、頂空固相微萃取（HS-SPME）結合GC-MS進行分析，通過自帶譜庫檢索分別得到離子流色譜圖（圖1）。結果顯示：戊烷∶乙醚（1∶1）與MTBE溶劑萃取的離子流色譜圖差異不顯著，2種溶劑萃取與頂空固相微萃取離子流色譜圖差異顯著，因此，后續對3種萃取方法提取的物質進行分析討論。

種萃取方法的黑胡椒揮發性成分分析

通過黑胡椒揮發性成分的分析結果顯示（表1），經3種方法萃取后共檢測到33種化合物，主要為萜烯類化合物。萜烯類化合物是一類廣泛存在于植物、動物體內的碳氫化合物。3種萃取方法中，頂空固相微萃取和戊烷∶乙醚（1∶1）溶劑萃取所測得的物質種類較多，分別為27種和25種，MTBE溶劑萃取測得23種化合物。頂空固相微萃取測得揮發性成分主要有β-石竹烯（15.82%±0.00%）、3-蒈烯（10.12%±0.01%）、檸檬烯（7.95%±0.01%）、α可巴烯（5.91%±0.00%），其特有成分為樟腦（0.05%±0.01%）、4-萜烯醇（0.10%±0.01%）、2-（4-甲基苯基）丙-2-醇（0.04%±0.01%）、橙花醇（0.04%±0.00%）、香樹烯（0.09%±0.00%）、β-甜沒藥烯（0.79%±0.01%）、愈創蘭油烴（0.05%±0.01%）;戊烷∶乙醚（1∶1）溶劑萃取的主要成分有3-蒈烯（21.02%±0.00%）、檸檬烯（14.97%±0.01%）、β-石竹烯（14.95%±?0.00%）、β-蒎烯（10.35%±0.01%）、α-水芹烯（7.47%±0.00%）、蒎烯（6.87%±0.00%）;MTBE溶劑萃取的主要成分有3-蒈烯（21.52%±0.00%）、檸檬烯（15.14%±0.01%）、β-石竹烯（15.51%±?0.01%）、β-蒎烯（9.98%±0.01%）、α-水芹烯（6.71%±0.01%）、蒎烯（6.33%±0.00%）。對比MTBE溶劑萃取與戊烷∶乙醚（1∶1）溶劑萃取發現，后者檢測到的揮發性成分數量及種類均高于前者，共有的3種化合物為α松油烯、α-松油醇和β-金合歡烯。

對比分析后發現，β-石竹烯、3-蒈烯、檸檬烯3種萜類化合物在3種萃取方法下的相對含量均最高。檸檬烯（limonene）又名苧烯，是一種單萜烯類化合物，主要存在于檸檬、柑橘、佛手精油中，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤活性、抑菌、利膽溶石、去痰止咳、鎮靜神經中樞等多種生理功效，大量文獻報道，檸檬烯對結腸癌、乳腺癌、胃癌、皮膚癌等癌細胞具有抑制作用。3-蒈烯是一種雙環單萜，是松樹精油的主要成分之一，除已知殺菌特性外，還具有抗炎、抗菌和抗焦慮的作用。與α可巴烯類似，3-蒈烯作為GABAA-BZD受體的正調節器，具有促進睡眠的作用。β-石竹烯是一種天然雙環倍半萜，具有抗炎、鎮痛、神經保護、抗腫瘤、防治肝損傷等廣泛的生物活性，并能通過興奮CB2受體及激活

內源性阿片鎮痛系統發揮鎮痛作用，激動脊髓等中樞系統的CB受體;以及對神經變性疾病具有神經保護作用。

種萃取方法的黑胡椒揮發性化合物分類

通過GC-MS分析檢測可知，3種不同萃取方法共檢測出6類化合物，分別為：烯類、醇類、酚類、烴類、崁類以及烯類氧化物。HS-SPME方法下檢測到5類化合物共27種，這種方法檢測的化合物總數最多，占總數36%。戊烷∶乙醚（1∶1）和MTBE溶劑萃取方法分別檢測到5類25種和23種揮發性化合物，其中，戊烷∶乙醚（1∶1）萃取方法檢測到烯類化合物數最多，為20種，占比達35.71%。HS-SPME萃取方法檢測到的醇類化合物數高于其他2種，有6種（圖2）。

種萃取方法的黑胡椒揮發性成分的主成分分析

主成分分析（principal component analysis， PCA）是一種把多個復雜指標簡化為幾個綜合指標的統計方法。本研究中3種萃取方法從黑胡椒樣品中共檢測到33種揮發性成分，以33種揮發性成分構成3×33矩陣進行主成分分析。結果如表2、表3所示，第1主成分方差貢獻率為92.811%，對其作出主要貢獻的物質有β-蒎烯、3-蒈烯、檸

檬烯、γ-松油烯、α-松油醇、β-石竹烯、β-金合歡烯、大根香葉烯D、γ-古蕓烯、氧化石竹烯，其對應的特征向量均大于1;第2主成分的方差貢獻率為7.168%，對其作出主要貢獻的物質有δ-欖香烯、α可巴烯、α-律草烯，其對應的特征向量均大于0.5。由表2可知，第1和第2主成分的累計貢獻率達99.979%，由此可見第1、第2主成分充分展現了原始變量的主要信息，也達到了此次進行主成分分析的目的。

從表3可知β-蒎烯、3-蒈烯、檸檬烯、β-石竹烯與第1主成分呈高度正相關，對黑胡椒的揮發性香氣影響較大;α可巴烯、β-石竹烯對第2主成分的香氣影響起到了決定性作用;δ-欖香烯成分在第3主成分中起到一定的作用。由黑胡椒

揮發性成分在主成分分析下的得分圖（圖3）可知，在PC1方向上3種萃取方法檢測到的揮發性成分差異顯著，大致可以分為3類：β-石竹烯為一類;β蒎烯、3-蒈烯、檸檬烯、萜品油烯及δ-欖香烯為一類;剩余的化合物歸為一類;而在PC2方向上各物質差異不顯著。

?討論

前人的研究多以水蒸氣蒸餾法和超臨界CO萃取法對胡椒中的香氣成分進行提取，與本研究的3種萃取方法所得結果進行對比分析，探討溶劑萃取法與傳統方法間的異同之處。

?頂空固相微萃取（）與種溶劑萃取的對比

本研究中頂空固相微萃取（HS-SPME）結合GC-MS檢測到黑胡椒中主要的揮發性成分有β-石竹烯（15.82%±0.00%）、3-蒈烯（10.12%±?0.01%）、檸檬烯（7.95%±0.01%）、α可巴烯（5.91%±0.00%），與侯冬巖等的研究結果相似，該研究利用水蒸氣蒸餾法對黑胡椒樣品進行萃取，最終結合GC-MS檢測到主要成分有石竹烯、蒎烯、蒈烯、檸檬烯;李祖光等利用固相微萃取結合GC-MS對黑胡椒粉末進行檢測后得到海南產黑胡椒特殊成分主要為β-石竹烯（47.30%）、3-蒈烯（11.48%）、β-水芹烯（8.22%）、欖香烯（5.25%）、β-蒎烯（2.43%），其中主要成分為β-石竹烯，與本研究結果一致。本研究中，與頂空固相微萃取相比，戊烷∶乙醚（1∶1）溶劑萃取檢測到含量最高的化合物為3-蒈烯，該化合物作為中草藥植物中的活性成分可直接通過植物進行利用，也能以天然精油的形式作為中間體或者配方原料用于醫藥、農藥、化妝品等行業。3種萃取方法檢測到的揮發性成分中，含量較高的化合物為β-石竹烯，是一種雙環倍半萜型化合物，具有丁香花香味，具有平喘、祛痰和抗炎作用。通過比較后發現，頂空固相微萃取檢測到的特有成分包括樟腦、4-萜烯醇、2-（4-甲基苯基）丙-2-醇、橙花醇、香樹烯、β-甜沒藥烯和愈創蘭油烴。其中樟腦因具有特征滲透性和輕微薄荷香氣被用于工業產品中的加香環節;橙花醇則常被用于制造香水及柑橘類香精。2種溶劑萃取的特有成分有α-松油烯、α-水芹烯、莰烯、鄰傘花烴及β-欖香烯。本研究表明，今后在胡椒游離態物質的鑒定過程中應將頂空固相微萃取法與溶劑萃取法相結合，使胡椒揮發性成分的檢測更為全面。

戊烷∶乙醚（）萃取與MTBE萃取的對比

前人常利用戊烷∶乙醚（1∶1）有機溶劑萃取法對香草蘭、葡萄酒等揮發性成分進行檢測;利用MTBE溶劑萃取對再造煙葉碎片原料中的香味物質進行研究。本研究中，戊烷∶乙醚（1∶1）與MTBE溶劑萃取法最終檢測到的化合物分別為25種和23種，前者檢測效率更高，而且前者比后者多檢測出α-松油烯、α-松油醇、β-金合歡烯3種物質，其中α-松油醇具有典型的丁香味，是最常用的日化香料物質之一，常用于肥皂和化妝品中。2種溶劑萃取的共有物質中有5種含量較高，分別為：β-蒎烯、α-水芹烯、3-蒈烯、檸檬烯和β-石竹烯，其中β-蒎烯作為日用香料常用于居家用品加香，同時也用于月桂烯的生產;α-水芹烯具有胡椒氣味，3-蒈烯具有一定的辛辣味，對黑胡椒的辛辣風味有一定貢獻，這些成分都可作為合成香料的主要原料。綜上所述，在黑胡椒的2種溶劑萃取方法中，戊烷∶乙醚（1∶1）萃取優于MTBE溶劑萃取。

種萃取方法與傳統方法——水蒸氣蒸餾法的對比

柳中等在對海南黑、白胡椒香氣成分的分析中，分別使用了固相微萃取、水蒸氣蒸餾法及同時蒸餾萃取法，其中采用水蒸氣蒸餾法共鑒定出37種化合物，其主要成分為3-蒈烯、α-水芹烯、β-月桂烯、檸檬烯、石竹烯等烯烴類物質。黃菲菲等利用水蒸氣蒸餾法對4種方式處理的黑胡椒香氣成分進行分析，分別鑒定出19、17、23、22種化合物，總檢出量在95%以上;在檢出物質中α蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、檸檬烯、蛇麻烯、β-石竹烯、β-甜沒藥烯等在4種處理方式檢測產品中的含量較高，最高的為β-石竹烯。侯冬巖等對水蒸氣蒸餾法提取黑胡椒的揮發性成分及其萜類化學成分進行分析，鑒定出黑胡椒揮發油中存在37個化合物，主要有β-蒎烯、3-蒈烯、α-水芹烯、檸檬烯、石竹烯、α-松油醇等。區敏港等采用水蒸氣蒸餾法提取黑胡椒精油，結合GC-MS分析檢測到化合物主成分有10種，其中含量較高的為α蒎烯、石竹烯、β-蒎烯、蛇麻烯等。在本研究中，采用3種萃取方法對黑胡椒香氣成分進行提取，結合GC-MS分析檢測到共有且含量較多的成分有β-蒎烯、3-蒈烯、檸檬烯、β-石竹烯，與前人研究結果相似。

?結論

本研究以黑胡椒為研究材料，以3種不同萃取方法對黑胡椒香氣成分進行提取，經GC-MS分析共檢測到33種物質，頂空固相微萃取法檢測到的27種物質中其特有成分為樟腦、4-萜烯醇、2-（4-甲基苯基）丙-2-醇、橙花醇、香樹烯、β-甜沒藥烯和愈創蘭油烴;戊烷∶乙醚（1∶1）溶劑萃取法和MTBE溶劑萃取法分別獲得25種和23種物質，其特有成分共包括α-松油烯、α-水芹烯、莰烯、鄰傘花烴及β-欖香烯。溶劑萃取法與頂空固相微萃取法相比，所得物質在種類與數量上均存在一定差異。2種方法相互補充可以在胡椒屬植物香氣物質鑒定中得到更加全面的檢測結果。

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