鄰苯二甲酸二乙基己酯與雙酚A聯合染毒對小鼠學習記憶障礙及淀粉樣前體蛋白酶解通路的影響

劉佳欣，付朝旭，代霖，金慧玲，許妍姬

延邊大學醫學院預防醫學教研室，延吉 133002

增塑劑具有延展性、能夠增加塑料的強度及穩定性，因此在現代生產生活中被大量應用到塑料制品中[1-2]，鄰苯二甲酸二乙基己酯(diethylhexyl phthalate, DEHP)是產量最大且被使用最為廣泛的一種增塑劑，也是人類經常暴露的環境污染物[3]；由于DEHP與塑料之間僅依靠鍵能較弱氫鍵或范德華力連接，其結合不緊密，導致了環境污染和對機體的毒性損傷[4]，本文將探討其對神經毒性的影響。另一種增塑劑雙酚A(bisphenol A, BPA)，是一種烷基酚類的環境內分泌干擾物，其在生殖毒性、肝臟毒性和免疫毒性方面的研究已得到證實[5-8]；隨著發展與進步，BPA的神經毒性逐漸受到關注。

DEHP和BPA這類的環境污染物對機體神經系統具有負面影響，現有研究表明，孕期母體攝入的DEHP會影響子代小鼠的神經發育[9]；人體主要通過經口、呼吸吸入、醫療和皮膚接觸等途徑暴露于DEHP中[10]，BPA主要經過環境和食物等途徑進入人體，在機體中能夠通過胎盤屏障和血腦屏障，從而損害中樞神經[11]。阿爾茲海默病(Alzheimer disease, AD)作為一種典型的中樞神經系統退行性疾病，起病隱襲且病程較為緩慢，容易受環境污染物的影響，淀粉樣前體蛋白(APP)酶解通路異常是AD致病機制中的重要過程。相關塑料制品的磨損老化以及高溫、強酸、強堿等條件下的使用使得人體經常同時暴露于2種毒物中。以往的研究中DEHP和BPA二者的單獨毒性作用均已得到證實[10-12]，實際生產生活中，由于人體經常會同時暴露在DEHP與BPA的環境中，其聯合毒性引發的安全問題需要重新進行探討；為探究二者的聯合毒性作用，為職業場所和生活場所DEHP和BPA聯合暴露導致的健康問題提供實驗參考和科學依據，本次實驗對小鼠進行聯合染毒并采用動物行為學測試和生化指標的檢測，探討BPA與DEHP聯合染毒的毒性作用與機制以及對小鼠學習記憶能力的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物

選擇80只SPF級昆明(Kun Ming, KM)種雄性小鼠，體質量為(20.0±2.0) g，由延邊大學動物科學實驗中心提供；在延邊大學醫學院動物飼養房集中飼養5 d，光、暗周期交替，溫度控制在22～25 ℃，相對濕度保持在40%～70%。

1.2 實驗儀器與試劑1.2.1 實驗儀器

酶標儀(美國伯騰儀器有限公司，型號BioTek)、超聲波細胞破碎機(上海喬躍電子有限公司，型號JY96-Ⅱ)、電泳儀(上海碧云天生物科技有限公司，型號165-8033)、小動物避暗穿梭測試儀(北京眾實迪創，型號YLS3TB)和小動物跳臺記錄儀(北京眾實迪創，型號YLS-17B)、Morri水迷宮(上海欣軟，型號XR-XM101)、高速冷凍離心機(Thermo Electron，型號CR3i)。

1.2.2 實驗試劑

雙酚A(純度99.0%，上海化成工業發展有限公司)、鄰苯二甲酸雙(2-乙基己基)酯(純度99.0%，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司)、吐溫80(純度99.0%，天津市科密歐化學試劑有限公司)；丙二醛(MDA)、乙酰膽堿酯酶(AchE)、單胺氧化酶(MAO)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒均購于南京建成生物工程有限公司；APP、PS1、tau、BACE1、tubulin抗體(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；Aβ1-42酶聯免疫試劑盒、β-分泌酶和γ-分泌酶聯免疫分析試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)。

1.3 試劑配制

將DEHP與吐溫80(Tween-80)按照體積為1∶1助溶，并使用雙蒸水配制成濃度分別為100、250和500 mg·kg-1的染毒液。將1 mg BPA溶解于10 mL的無水乙醇，加入1 L水配制成1 mg·L-1的染毒液；2種毒物均采用灌胃染毒的方式對小鼠進行染毒處理。

1.4 實驗分組與模型建立

白金等[13]通過對小鼠進行染毒，研究DEHP對雄性小鼠大腦皮質氧化損傷及Bcl-2、Bax蛋白表達影響，結果表明，DEHP各染毒組的大腦皮質Bcl-2蛋白表達減少，500 mg·kg-1和1 000 mg·kg-1劑量組Bax蛋白表達增高，提示DEHP可致小鼠大腦皮質氧化損傷及凋亡相關蛋白改變；馮強偉[14]進行了DEHP聯合甲醛暴露實驗，生化指標測試結果表明，1.0 mg·m-3和3.0 mg·m-3甲醛與500 mg·kg-1DEHP以及聯合暴露組1.0 mg·m-3甲醛+50 mg·kg-1DEHP和3.0 mg·m-3甲醛+500 mg·kg-1DEHP可以導致小鼠氧化損傷、炎癥反應。本次實驗以此為依據確定了染毒暴露組濃度[14]。選擇80只昆明種小鼠，隨機分為8組，每組各10只，具體分組如表1所示。

BPA和DEHP處理組每天按照0.01 mL·g-1的劑量對小鼠進行灌胃染毒，對照組按照相同比例的劑量給予雙蒸水(double distilled water, DDW)灌胃處理，各組均自由攝食、飲水，連續染毒42 d。實驗期間，每天觀察小鼠的毛色、呼吸和狀態，并記錄各組小鼠的體質量、攝食量以及飲水量。

表1 實驗分組與染毒劑量(n=10)Table 1 Experimental grouping and exposure dose (n=10)

1.5 動物行為學實驗1.5.1 小鼠Morris水迷宮測試

實驗周期的第42天進行小鼠Morris水迷宮訓練，訓練期間照常定時給藥。水迷宮由直徑為1.2 m的圓形水池構成，水池分為4個象限，平臺位于第4象限，水池水位位于平臺上2 cm處，由頂部攝像頭進行錄像拍攝。實驗過程中，水溫保持在(23±1) ℃。實驗前5 d為定位航行實驗：每次將小鼠的頭朝向池壁，分別從1、2、3、4象限的固定位置投入水池中，時長為60 s,記錄小鼠從不同象限游上平臺的時間，在平臺停留5 s為成功上臺；若未能成功找到平臺，則通過引導棒將其引導上臺，并讓小鼠在平臺停留10 s，增強學習記憶能力。每間隔24 h訓練一次，訓練5 d；第6天、第7天、第9天進行空間探索實驗，將小鼠從平臺對角線的象限固定點投入水中，記錄路線、穿臺次數和目標象限停留時間，以此來測試小鼠的空間學習記憶能力。

1.5.2 小鼠避暗實驗

第6周時訓練，分為模擬訓練和正式測試。將小鼠放進避暗儀的明箱中，使其消除恐懼，適應環境；3 min后打開明暗室的隔板，開啟避暗儀進行測定，電壓設定為36 V，持續記錄5 min，24 h后進行相同的測試為正式測試，記錄小鼠第1次從明箱到暗箱受到電擊所用的時間和小鼠從明箱穿梭到暗箱受到電擊的次數，即其潛伏期和錯誤次數。

1.5.3 小鼠跳臺實驗

第6周時進行訓練，分為模擬訓練和正式測試2部分。實驗開始之前將動物放入跳臺箱內適應3 min，底部通電，動物受到電刺激，正常反應時跳上平臺躲避傷害性刺激，染毒作用的小鼠會削弱這種反應記憶能力；第2天將小鼠再次重復該操作，進行正式測試，時間設置為5 min，觀察并記錄小鼠從絕緣平臺跳下所花費的時間和小鼠從平臺跳下的次數，即逃避潛伏期和跳臺錯誤次數。

1.6 生化指標的測定1.6.1 小鼠腦組織MDA含量以及MAO、AchE、CAT活性的檢測

小鼠處死后置于冰上取腦，用天平稱其1/4的質量，按照9(mL)∶1(g)的比例加入生理鹽水，置于冰上用粉碎機進行粉碎，2 500 r·min-1離心10 min，取其上清液，嚴格按照試劑盒說明書對樣本進行檢測。

1.6.2 ELISA法檢測腦組織中β、γ-分泌酶活性和Aβ1-42含量

小鼠處死后置于冰上取腦，用天平進行準確稱量，按照9(mL)∶1(g)的比例加入PBS，置于冰上用粉碎機粉碎，離心后取上清液，采用ELISA法進行檢測。嚴格按照說明書進行操作。

1.6.3 腦組織中APP、PS1、BACE1和Tau蛋白表達水平的檢測

采用蛋白印跡法，殺鼠后將腦組織加入RIPA緩沖液和PMSF，充分研磨，超聲粉碎，再次加入PMSF，冰上孵育30 min，離心后取上清液，嚴格根據說明書測得蛋白濃度。在SDS-PAGE凝膠中進行電泳，取樣量為20 μL，電泳后轉移印記至PVDF膜，洗滌液洗滌，封閉液封閉2 h，加入一抗后在搖床中震蕩1.5 h后，4 ℃冰箱孵育過夜，次日回收一抗，洗滌后在搖床中孵育二抗1 h，回收二抗，再次洗滌，曝光取影，觀察各組蛋白表達水平。

1.7 免疫組化染色

將固定在10%福爾馬林固定液中的腦組織依次進行脫水、石蠟包埋、切片、HE染色、封片和顯微鏡觀察等操作，觀察腦組織海馬區的形態及結構差異。

1.8 聯合毒性評價分析

目前聯合染毒作用評價方式主要有濃度加和模型(CA)、效應相加模型(ES)、獨立作用模型(IA)和聯合指數法(CI)[15-16]。為更具有統計學意義，本實驗采用效應相加模型進行評價。該模型假設各物質之間不存在相互作用，將這2種毒物聯合處理時的毒性效應作為“實測值”，單獨處理時的毒效應作為“預測值”，2個值進行顯著性差異分析判斷其聯合作用；若該項指標實測值大于預測值，聯合染毒作用表現為協同作用。

1.9 統計學方法

采用SPSS26.0軟件進行單因素方差分析，組間差異使用LSD-t的檢驗方法，P<0.05為具有統計學差異。

2 結果(Results)

2.1 小鼠Morris水迷宮實驗

空間探索結果表明，對照組小鼠穿臺次數明顯高于其他組，目標象限停留時間較長，空間探索具有較強的目的性；DEHP和BPA單獨作用組小鼠軌跡雜亂，對于平臺的記憶能力較弱；聯合染毒組幾乎不穿過目標象限，軌跡極其不規律，空間探索能力很差；與對照組相比，差異性具有統計學意義(P<0.05)(表2和圖1)。

表2 定位航行實驗逃避潛伏期Table 2 Evasion incubation period of positioning navigation experiment n=10)

圖1 各組空間探索實驗活動軌跡Fig. 1 The trajectory of each group of space exploration experiments

2.2 避暗和跳臺實驗

與對照組相比，BPA或DEHP單獨染毒組以及聯合染毒組的潛伏期縮短，錯誤次數明顯增加(P<0.05)，聯合染毒組與其對應的單獨染毒組比較，其逃避潛伏期與錯誤次數均具有統計學意義(P<0.05)(圖2)。

2.3 小鼠腦組織MDA含量以及MAO、AchE和CAT活性的檢測結果

與對照組相比，染毒組MDA含量、MAO和AchE活性逐漸增加，腦組織中CAT活性逐漸降低，具有顯著差異性(P<0.05)；聯合染毒組與對應的單獨染毒組相比，MDA含量、MAO和AchE活性明顯增加，CAT活性明顯降低(P<0.05)，實測值超過其理論值，表現為協同作用(表3)。

2.4 小鼠腦組織β、γ-分泌酶活性和Aβ1-42的含量

與對照組相比，單獨染毒組與聯合染毒組的β、γ-分泌酶活性和Aβ1-42的含量增多(P<0.05)，聯合染毒組與其對應的單獨染毒組比較，β、γ-分泌酶活性和Aβ1-42的含量增加更明顯(P<0.05)(圖3)。

2.5 蛋白表達水平

與正常組對比，單獨染毒組APP、PS1、BACE1和Tau蛋白表達水平明顯增強(P<0.05)，其中，聯合染毒組APP、PS1、BACE1和Tau的蛋白表達水平明顯高于單獨染毒組(P<0.05)(圖4)。

圖2 各組避暗、跳臺實驗潛伏期和錯誤次數的比較注：a表示與CT組比較，P<0.05；b表示與BPA組比較，P<0.05；c表示與相同劑量DEHP染毒組比較，P<0.05；1表示CT組，2表示BPA組，3表示低DEHP組，4表示中DEHP組，5表示高DEHP組，6表示低DEHP+BPA組，7表示中DEHP+BPA組，8表示高DEHP+BPA組。Fig. 2 Comparison of the latency and the number of errors in the dark avoidance and platform jump experiments in each groupNote: a means compared with CT group, P<0.05; b means compared with BPA group, P<0.05; c means compared with the same dose of DEHP group, P<0.05; 1 indicates CT group; 2 indicates BPA group; 3 indicates low dose DEHP group; 4 indicates medium dose DEHP group; 5 indicates high dose DEHP group; 6 indicates low dose DEHP+BPA group; 7 indicates medium dose DEHP+BPA group; 8 indicates high dose DEHP+BPA group.

表3 小鼠腦組織中丙二醛(MDA)含量、單胺氧化酶(MAO)、乙酰膽堿酯酶(AchE)和過氧化氫酶(CAT)活性的比較Table 3 Comparison of malondialdehyde (MDA) content and the activities of monoamine oxidase (MAO), acetylcholinesterase (AchE) and catalase (CAT) in mouse brain tissue n=10)

圖3 小鼠腦組織中β-分泌酶、γ-分泌酶活性和Aβ1-42含量注：a表示與CT組比較，P<0.05；b表示與BPA組比較，P<0.05；c表示與相同劑量DEHP染毒組比較，P<0.05；1表示CT組，2表示BPA組，3表示低DEHP組，4表示中DEHP組，5表示高DEHP組，6表示低DEHP+BPA組，7表示中DEHP+BPA組，8表示高DEHP+BPA組。Fig. 3 The activities of β-secretase, γ-secretase and Aβ1-42 content in mouse brain tissueNote: a means compared with CT group, P<0.05; b means compared with BPA group, P<0.05; c means compared with the same dose of DEHP group, P<0.05; 1 indicates CT group; 2 indicates BPA group; 3 indicates low dose DEHP group; 4 indicates medium dose DEHP group; 5 indicates high dose DEHP group; 6 indicates low dose DEHP+BPA group; 7 indicates medium dose DEHP+BPA group; 8 indicates high dose DEHP+BPA group.

2.6 腦組織海馬區HE染色結果

采用HE染色方法對小鼠進行腦組織石蠟切片并染色，觀察其海馬區形態變化及病理性特征。對照組形態正常，海馬神經元細胞排列整齊，顏色較淺，形態正常；單獨染毒組排列不規則且雜亂，染色顏色較深。聯合染毒組與其對照組相比：其細胞核較多，顏色較深，呈現出更深的顏色，排列極其不規則(圖5)。

3 討論(Discussion)

DEHP與BPA經常聯合暴露于職業環境和室內空氣環境中，例如，化工行業用作原料生產的各類塑料制品、醫療器械和餐飲食品外包裝等[17-18]，二者聯合毒性作用值得探討。

環境污染物是近年來影響健康的不可忽視因素，日常暴露的環境污染物除了損傷呼吸系統、循環系統和肝臟系統外，大腦亦是其攻擊的靶點之一[19]，AD作為最常見的一種神經退行性疾病，與環境污染物的暴露存在密切關系。Feng等[20]的研究表明，DEHP的潛在神經毒性機制可能與cAMP-PKA-ERK1/2-CREB信號傳導和Ca2+信號傳導途徑協同介導相關，這與本實驗發現的APP酶解通路異常存在潛在的關聯性。DEHP由于可以通過血腦屏障，接觸后會在大腦中積累，通過調節突觸前膜Ca2+通道的活力對中樞神經系統產生影響；現有研究表明，DEHP是一種過氧化物酶體增殖劑，通過激活生物體內過氧化物酶體增殖物從而激活受體(PAPR)，使活性氧為主的各種自由基增加，從而導致氧化應激[21-22]，加速細胞凋亡，與本實驗MDA、CAT、MAO和AchE等生化指標的檢測結果相符。研究表明，BPA通過影響神經元細胞的遷移，造成神經遞質和突觸可塑性的形成障礙，降低海馬體中椎體神經元的樹突棘密度，影響突觸可塑性持續重塑，因此難以建立復雜的大腦神經元網絡[23]，從而引起認知功能障礙和學習記憶能力的衰退。

行為學實驗結果表明，BPA與DEHP均會對小鼠學習記憶能力產生消極影響，使其空間定位能力出現障礙，聯合染毒組神經毒性作用明顯高于單獨染毒組，使用效應相加模型進行評價，表現為協同作用。

圖4 各組APP、PS1、BACE1和Tau蛋白表達注：a表示與CT組比較，P<0.05；b表示與BPA組比較，P<0.05；c表示與相同劑量DEHP染毒組比較，P<0.05；1表示CT組，2表示BPA組，3表示低DEHP組，4表示中DEHP組，5表示高DEHP組，6表示低DEHP+BPA組，7表示中DEHP+BPA組，8表示高DEHP+BPA組。Fig. 4 APP, PS1, BACE1 and Tau protein expression in each groupNote: a means compared with CT group, P<0.05; b means compared with BPA group, P<0.05; c means compared with the same dose of DEHP group, P<0.05; 1 indicates CT group; 2 indicates BPA group; 3 indicates low dose DEHP group; 4 indicates medium dose DEHP group; 5 indicates high dose DEHP group; 6 indicates low dose DEHP+BPA group; 7 indicates medium dose DEHP+BPA group; 8 indicates high dose DEHP+BPA group.

圖5 蘇木精-伊紅(HE)染色小鼠海馬組織神經元形態Fig. 5 Hematoxylin-Eosin (HE) staining neuron morphology of mouse hippocampus

為進一步探討其毒性作用及機制，對MDA、CAT、MAO和AchE等生化指標進行檢測。結果提示，隨著DEHP濃度增加，MDA含量、MAO和AchE活性逐漸增加，聯合染毒組MDA含量、MAO和AchE活性增加明顯，實測值超過其理論值，表現為協同作用。聯合染毒組與對照組及單獨染毒組相比，腦組織中CAT活性逐漸降低，通過觀察其活性可以判斷經聯合染毒處理的小鼠腦組織氧化應激損傷程度更高；提示聯合染毒處理組的小鼠體內活性氧作用增加，抗氧化能力降低，抵抗衰老和認知功能障礙的能力減退[24]。神經遞質釋放量的正常與穩定，是保證學習記憶能力的重要環節[25-26]；本實驗中生化指標結果顯示染毒處理組小鼠腦組織中單胺類神經遞質與乙酰膽堿類神經遞質含量減少，提示其發生學習記憶功能障礙。

秦晉等[27]研究發現，DEHP可引起INS-1細胞氧化應激，使線粒體膜電位降低，誘導細胞凋亡。異常的細胞代謝反過來會影響β-淀粉樣蛋白(amyloid, Aβ)和過度磷酸化Tau蛋白的產生與積累，這會加劇線粒體功能障礙和活性氧(ROS)的產生，從而導致惡性循環[28-29]。Aβ由APP經過β、γ-分泌酶水解產生，正常情況下APP經α-分泌酶水解產生可溶性的SAPP-α和CTFα，此途徑可阻止Aβ的形成和沉積[30]，而經過γ-分泌酶水解會產生異常的Aβ，目前認為Aβ1-42是細胞外淀粉樣變性的主要成分，神經元內的病變也與Aβ1-42相關。實驗結果顯示，各染毒處理組β、γ-分泌酶活性增加，Aβ1-42含量增加，聯合染毒組相比單獨染毒組酶活性增加更為明顯。

APP酶解通路是造成學習記憶障礙和AD發病的關鍵機制，相關中樞神經系統過度磷酸化的Tau神經原纖維纏結(NFTs)和細胞外淀粉樣老年斑(SP)是AD的主要病理變化特征[29](圖6)。神經原纖維纏結的主要成分是異常沉積的tau蛋白，SP的核心成分是Aβ[31-32]。本實驗通過測定相關生化指標及蛋白表達發現DEHP與BPA聯合染毒對小鼠學習記憶損傷作用與APP酶解通路異常有關。

圖6 淀粉樣前體蛋白(APP)酶解通路示意圖Fig. 6 Schematic diagram of amyloid precursor protein (APP) processing pathway

聯合染毒毒性作用評價目前主要有濃度加和模型(CA)、效應相加模型(ES)、獨立作用模型(IA)和聯合指數法(CI)[15-16]。本次實驗選擇了效應相加模型判斷，通過效應相加模型研究可知，DEHP與BPA二者聯合染毒，毒性作用增強，表現為協同作用，這與化學毒物自身的結構及內部相關反應結合有關，有待于進一步探討。未來降低環境污染物的重要途徑可以是研發DEHP和BPA的替代品，從根源上降低環境污染物對機體神經系統、生殖系統等方面的損害作用，從而降低和避免環境污染物聯合暴露對人類造成的損害。

綜上所述，BPA與DEHP聯合染毒對小鼠腦組織具有明顯的神經毒性作用，其聯合作用表現為協同作用，造成小鼠的認知功能障礙，損傷神經系統結構，機制可能與氧化應激及APP酶解通路異常相關，更深的分子生物學機制有待于進一步的研究。

通訊作者簡介：許妍姬(1973—)，女，博士，教授，主要研究方向為神經毒理學。