豬瘟病毒免疫過氧化物酶單層細胞試驗檢測方法的建立

朱海俠 陳 雷 查代燦 張惠云 胡曉涵 包松英

（兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014）

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（CSFV）引起的豬和野豬高接觸性、高致病性的傳染病[1]，給我國養豬業造成巨大經濟損失。該病一年四季均可發生，但以春、夏等多雨季節多發。不同日齡、不同品種的家豬和野豬對豬瘟病毒均易感。該病被世界動物衛生組織列為A類烈性傳染病，被我國農業部列為一類傳染病，是目前阻礙我國養豬業健康發展的首要動物傳染病[2]。疫苗免疫接種是防控該病的主要措施，豬瘟大流行現狀已經得到根除，但仍存在區域性、點狀散發性流行[3]。究其原因，豬瘟疫苗的抗原含量是影響豬群免疫效果的重要因素之一。

目前針對豬瘟病毒的檢測主要有RT-PCR檢測技術、熒光定量PCR檢測方法、LAMP方法、免疫熒光技術（IFA）、兔體定型熱反應等。PCR相關技術主要針對的是病毒核酸，因此，在弱毒疫苗的評定過程中很難準確確定其活病毒的含量。由于豬瘟病毒感染細胞后不產生細胞病變，其病毒含量的測定主要依賴于傳統的免疫熒光技術或兔體定型熱反應進行判定。兔體定型熱反應作為一種檢測豬瘟弱毒疫苗效價的傳統方法，受大兔個體差異影響較大，且耗時較長，費用較高。IFA檢測方法是目前檢測CSFV的一種重要的輔助方法，但該方法對設備要求較高，不利于推廣應用。

免疫過氧化物酶單層細胞試驗（IPMA），其主要原理是通過抗原抗體的相互作用，產生特異性顯色反應，通過光學顯微鏡肉眼即可觀察并判定結果[4]。此外，制備的細胞板可以在4℃條件下長期保存，反應結果也可以長期儲存，隨時觀察[5]。本研究采用免疫過氧化物酶單層細胞試驗，建立一種能夠快速應用于生產中的病毒含量檢測方法，旨在為豬瘟疫苗生產提供快速的評價工具。

1 材料與方法

1.1 毒株、細胞系豬瘟病毒C株、ST細胞系由兆豐華生物科技（福州）有限公司保存。

1.2 主要耗材3-氨基-9-乙基咪唑（AEC）、羊抗兔HPR-IgG購自Sigma公司；試驗用陽性血清為豬瘟病毒（C株）免疫家兔后制備的高免血清樣品；陰性血清為健康家兔血清樣品；PEDV陽性、PRRSV陽性及PCV2陽性血清均由本公司保存備用；96孔細胞培養板購自costar公司；DMEM培養基購自GBICO；BSA購自Biosharp；其余分析純試劑購自國藥公司。

1.3 IPMA步驟將生長狀況良好的ST細胞鋪于96孔細胞培養板，置37℃、5%CO2培養箱中進行培養，細胞長至70%～80%時，棄去培養液，接種一定濃度的豬瘟病毒，37℃、5%CO2培養箱孵育1 h，期間每20 min搖晃一次，同時設立未接毒的對照組。吸附結束后，加入一定量DMEM液體繼續培養一段時間；棄去培養液，用一定量PBS進行潤洗，洗滌3次，干燥后加入含0.3%H2O2的甲醇溶液進行固定，作用10 min；棄去液體，用一定量PBS進行潤洗后干燥處理，加入0.02%trition作用10 min；棄去液體，用一定量PBS進行潤洗后干燥處理，加入一定量5%BSA(Bovine serum albumin)進行封閉2 h；棄去液體，用一定量PBS進行潤洗后干燥處理，加入一定濃度的高免血清作為一抗，37℃作用一段時間；棄去液體，用一定量PBS進行潤洗后干燥處理，加入一定濃度羊抗兔HRP-IgG二抗，37℃作用一段時間；棄去液體，用一定量PBS進行潤洗后干燥處理，加入AEC，37℃作用15 min，ddH2O終止，光學顯微鏡下觀察結果。

1.3.1 IPMA反應條件的優化

1.3.1.1 最佳一抗、二抗工作濃度及病毒作用時間的確定 取細胞長至70%～80%的96孔細胞培養板，加入已知濃度的豬瘟病毒，設置不加病毒對照孔，孵育1 h后，加入DMEM液體培養基，37℃、5%CO2培養箱分別作用24 h、48 h，72 h后進行固定處理， 加 入1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶300、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200稀釋的一抗，每個稀釋度加一縱列，將羊抗兔HRP-IgG抗體按照1∶250、1∶500、1∶1 000、1∶2 000比例進行稀釋，每個稀釋度加一橫列，100 uL/孔，每個濃度設2個重復孔，同時設置陰性對照和空白對照，按照上述步驟，觀察染色結果，確定最佳一抗、二抗及病毒作用時間。

1.3.1.2 固定液的選擇 棄去細胞培養液，用PBS潤洗3次，分別加入含0.3%H2O2的甲醇、80%丙酮、33%丙酮溶液進行固定，室溫固定10 min后，棄去固定液，用PBS潤洗2次，按照上述步驟進行測定，顯微鏡下觀察結果，確定最佳固定液。

1.3.1.3 最優二抗工作時間的確定 將辣根過氧化物酶（HPR）標記的羊抗兔IgG按照1∶1 000比例進行稀釋，100 uL/孔，置37℃分別孵育0.75 h、1 h、2 h，PBST洗滌3次，按照上述步驟進行測定，顯微鏡下觀察結果，確定最優二抗工作時間。

1.3.1.4 顯色時間確定 AEC試劑根據配比要求進行配制，100 uL/孔，置室溫和37℃分別作用15 min、20 min、30 min，按照上述步驟進行測定，顯微鏡下觀察結果，確定最佳顯色時間。

1.3.2 IPMA檢測方法的特異性分析 用PEDV、PRRSV、PCV2陽性血清和豬瘟病毒（CSFV）陽性高免血清進行特異性檢測，判定該方法的特異性。

1.3.3 IPMA檢測方法重復性分析 分別制備3個批次的96孔細胞培養板，選用已知濃度的病毒按照一定比例進行稀釋后，接種于96孔細胞培養板中，同時設置不接病毒的空白對照，每個樣本做3個重復，分別進行組內及組間的重復性測定。

1.3.4 IPMA檢測方法與IFA方法符合率分析 對建立的IPMA檢測方法與IFA方法進行對比，分析同一批次、相同稀釋度豬瘟病毒檢測情況。

2 結果與分析

2.1 IPMA條件優化本研究確定最優反應條件為：豬瘟病毒接種后繼續培養72 h，用含0.3%H2O2甲醇溶液室溫固定10 min，5%BSA 37℃作用2 h，一抗按照1∶200進行稀釋，37℃孵育2 h，二抗按照1∶1 000進行稀釋，37℃孵育45 min，置37℃顯色20 min具有較好的顯色效果（見圖1）。

圖1 不同樣品AEC染色效果

2.2 最佳固定液的確定選用不同類型的固定液進行固定，結果發現33%丙酮溶液進行固定時會導致細胞迅速脫落，采用80%丙酮溶液與0.3%H2O2甲醇溶液相比，細胞會出現脫落現象，且染色后細胞邊界模糊，效果稍差于0.3%H2O2甲醇溶液（見圖2）。

圖2 不同固定液處理后細胞染色效果

2.3 IPMA檢測方法的特異性分析采用上述方法對PEDV、PRRSV、PCV2、CSFV陽性血清樣品進行測定，結果表明：除豬瘟病毒陽性血清出現特異性顏色反應外，其余病毒陽性血清均無染色反應。

2.4 IPMA檢測方法的重復性分析采用上述方法對不同批次制備的細胞進行豬瘟病毒含量測定，結果無明顯差異，表明建立的方法具有很好的重復穩定性。

2.5 IPMA檢測方法與IFA比較分析采用同一批細胞不同試驗方法對同一批次、相同稀釋度的豬瘟病毒進行測定，IPMA檢測結果與IFA方法相符合（見圖3）。

圖3 不同試驗方法對比分析

3 討 論

IPMA與IFA檢測方法一樣，具有良好的特異性、敏感性等特點，解決了病毒感染細胞無細胞病變、難以判定細胞是否感染的難題[6]。該方法因操作簡便、能夠長期保存試驗結果等優勢在疫病檢測中得到廣泛應用[7-9]。本研究通過病毒感染時間、固定液選擇、一抗和二抗、顯色的最優工作條件確定，建立了豬瘟病毒的IPMA檢測方法。通過加入一定量的Trition和BSA進行細胞通透和封閉，極大提高病毒侵染細胞的效果和降低背景的干擾，降低非特異性反應的發生，為建立豬瘟病毒的IPMA檢測方法奠定基礎。

疫苗免疫是預防疫病發生和流行的重要途徑，雖然豬瘟弱毒疫苗的應用在一定程度上控制了豬瘟的流行，但仍出現免疫失敗的情況。OIE-WAHIS實時數據顯示，我國豬瘟疫情仍處于散發、流行的情況。王琴等[10]澄清了“由野毒株變異引起免疫失敗”的學術爭端，指出豬瘟弱毒疫苗（C株）能抵抗全世界流行的三個基因型野毒的攻擊。CFSV在細胞增殖中效價高低及最終疫苗生產質量與動物免疫效果密切相關[11]。黃寶學等[12]指出，不同病毒含量豬瘟疫苗的免疫效果存在一定差異，疫苗中病毒含量過高會導致免疫耐受，病毒含量過低則不能誘導機體產生足夠的抗體水平。因此，豬瘟弱毒疫苗中病毒含量是影響疫苗使用效果的關鍵。

本研究建立了能夠快速檢測豬瘟病毒復制情況的IPMA方法。雖然該方法已有在豬瘟病毒效價測定方面應用的報道[6,9]，但本研究中主要采用極易獲取的高免血清作為一抗，解決了單克隆抗體難以篩選的難題。采用特異性HRP-IgG作為二抗，極大提高了檢測方法的特異性和推廣的可行性。通過固定液的篩選及封閉條件的加入，大大降低了細胞脫落的幾率及本底反應，降低了主觀誤判的概率。