瑞士乳桿菌對(duì)泥鰍腸道轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)的影響

崔曉琳，丁志雯，米浩宇，孟文蓉，劉 姝，楊 光，侯曉月，董志國(guó)，房耀維

( 1.江蘇海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇 連云港 222005； 2.江蘇海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005 )

泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)分布于中國(guó)各地，主要分布于長(zhǎng)江流域。由于其優(yōu)越的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的風(fēng)味，在東亞地區(qū)廣受歡迎[1-2]。近年來(lái)，泥鰍在國(guó)內(nèi)外的需求量年年攀升，是我國(guó)外貿(mào)出口的重要水產(chǎn)品之一[3]。基于此，泥鰍在我國(guó)一直是重要的淡水養(yǎng)殖品種。隨著養(yǎng)殖技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，集約化和工廠化的養(yǎng)殖模式發(fā)展迅速，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，但因養(yǎng)殖過(guò)程中出現(xiàn)的病害較多，抗生素使用廣泛，耐藥性和藥物殘留的問(wèn)題也日益突出，嚴(yán)重影響農(nóng)民的增產(chǎn)增收，一定程度上阻礙了泥鰍產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[4-5]。

飼喂益生菌是一種持久的、環(huán)境友好型的且能夠替代抗生素的魚類疾病解決方案之一，使水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)朝著綠色健康養(yǎng)殖的方向發(fā)展。益生菌作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的安全添加劑，通過(guò)促進(jìn)生長(zhǎng)、提供營(yíng)養(yǎng)、調(diào)節(jié)微生物定殖、提高免疫反應(yīng)、提高飼料利用率、增加消化酶活性和消化率、改善水質(zhì)和控制疾病等來(lái)提高宿主的健康水平[6-7]。目前報(bào)道的在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的益生菌主要有酵母菌(Saccharomycetes)、芽孢桿菌(Bacillus)、乳桿菌(Lactobacillus)及光合細(xì)菌等[8]。Kim等[9]證明乳酸乳桿菌(L.lactis)BFE920對(duì)鏈球菌(Streptococcus)具有很強(qiáng)的抗菌活性，在褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)的養(yǎng)殖中提高了魚體的消化率和質(zhì)量增加率。芽孢桿菌能夠抑制潛在病原體在蝦腸道內(nèi)的定殖，從而提高凡納濱對(duì)蝦的免疫力和抗病性[10-12]。益生菌的作用機(jī)制除了直接的抑菌作用外，還有對(duì)消化道和免疫系統(tǒng)的影響。據(jù)報(bào)道，有益微生物可在養(yǎng)殖對(duì)象體內(nèi)產(chǎn)生多種消化酶，從而提高飼料利用率[13-14]。乳桿菌以某種免疫調(diào)節(jié)因子的形式起作用，刺激腸道某種局部性免疫反應(yīng)[15-16]。但是，與抗生素相比，益生菌的作用機(jī)理在理論研究上還不夠深入，此外，乳酸菌在泥鰍的健康養(yǎng)殖中的研究較少，相關(guān)機(jī)制研究鮮有報(bào)道。

筆者對(duì)投喂瑞士乳桿菌(L.helveticus)HML037的泥鰍轉(zhuǎn)錄組基因的表達(dá)影響進(jìn)行探索，以期解釋瑞士乳桿菌HML037對(duì)泥鰍的生長(zhǎng)和免疫反應(yīng)的分子機(jī)制，為益生菌的促生長(zhǎng)和免疫作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，為乳酸菌在泥鰍的健康養(yǎng)殖提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

泥鰍購(gòu)于江蘇連云港贛榆養(yǎng)殖技術(shù)服務(wù)中心，體質(zhì)量(3.14±0.17) g。瑞士乳桿菌HML037自馬奶中篩得，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)烏云達(dá)來(lái)教授所贈(zèng)。

1.2 泥鰍的養(yǎng)殖

選取120尾泥鰍隨機(jī)分到6個(gè)70 L聚氯乙烯水族缸(20尾/箱)中，試驗(yàn)分為2組：瑞士乳桿菌HML037組和對(duì)照組，每組3個(gè)平行。每日7：00和18：00對(duì)泥鰍進(jìn)行投喂，投喂量為其體質(zhì)量的3%，飼養(yǎng)8周。

1.3 組織收集和RNA制備

泥鰍喂養(yǎng)8周后，對(duì)照組和瑞士乳桿菌HML037組分別取泥鰍6尾，解剖取其腸道組織，并-80 ℃保存用于RNA制備。根據(jù)總RNA提取試劑盒(Trizol)說(shuō)明書，對(duì)采集的泥鰍腸道組織樣品進(jìn)行RNA提取。用Qubit 2.0熒光計(jì)檢測(cè)RNA濃度，瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA完整性以及基因組污染情況。最后將總RNA送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司測(cè)序。

1.4 文庫(kù)構(gòu)建和RNA測(cè)序

通過(guò)Oligo(dT)磁珠(Illumina, 美國(guó))富集帶有polyA尾的mRNA，隨后在NEB Fragmentation Buffer中用二價(jià)陽(yáng)離子將得到的mRNA隨機(jī)打斷。以片段化的mRNA為模版，隨機(jī)寡核苷酸為引物，在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA第一條鏈，隨后用RNaseH降解RNA鏈，并在DNA polymerase Ⅰ體系下,以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過(guò)末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，用AMPure XP beads篩選250～300 bp的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，最終獲得文庫(kù)。cDNA文庫(kù)在Illumina HiSeqTM2500上測(cè)序。

1.5 轉(zhuǎn)錄組De nove組裝、質(zhì)量評(píng)估和注釋

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在Illumina HiSeq 2000平臺(tái)上進(jìn)行，該平臺(tái)產(chǎn)生約100 bp的配對(duì)末端(PE)原始讀數(shù)(北京諾禾致源生物信息科學(xué)技術(shù)有限公司)。去除銜接序列、不明確的“N”核苷酸(N的比率大于10%)和低質(zhì)量序列(質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于5%)后，使用Trinity軟件組裝剩余的干凈讀數(shù)，如無(wú)參基因組的從頭轉(zhuǎn)錄組組裝所述[17]。

將unigenes與公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，并基于基因的相似性進(jìn)行功能注釋。使用NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)將unigenes與Nr、Nt、Swiss-Prot、GO、COG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比較。如果不同數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果有沖突，則遵循Nr、Nt、KEGG、Swiss-Prot、GO和COG數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)優(yōu)先順序。

1.6 差異基因表達(dá)

使用DESeqR包(1.10.1)進(jìn)行兩個(gè)條件/組的差異表達(dá)分析。DESeq提供統(tǒng)計(jì)程序，用于使用基于負(fù)二項(xiàng)分布的模型確定數(shù)字基因表達(dá)數(shù)據(jù)中的差異表達(dá)。使用Benjamini和Hochberg的方法調(diào)整得到的P值以控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率。由DESeq發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)整的P<0.05的基因被指定為差異表達(dá)。采用GOseq和KOBAS軟件對(duì)差異基因集進(jìn)行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析等。富集分析基于超幾何分布原理，其中差異基因集為差異顯著分析所得差異基因并注釋到GO或KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的基因集，背景基因集為所有進(jìn)行差異顯著分析的基因并注釋到GO或KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的基因集。富集分析結(jié)果是對(duì)每個(gè)差異比較組合的所有差異基因集、上調(diào)差異基因集、下調(diào)差異基因集進(jìn)行富集。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

參照說(shuō)明書，使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(Takara，日本)選擇9個(gè)基因(TRP、TMSB10、APC11、COLEC12、TNFRSF10、IL-10、IL-1B、FGL和IL-5)，β-actin作為內(nèi)參基因，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證RNA序列結(jié)果。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。用優(yōu)化的比較Ct(2-ΔCt)值法估計(jì)基因表達(dá)水平。數(shù)據(jù)用3個(gè)平行試驗(yàn)的平均值表示[18]。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和De nove組裝

對(duì)對(duì)照組和瑞士乳桿菌HML037組的泥鰍進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分別獲得21 626 795和23 112 691 個(gè)原始讀長(zhǎng)。兩組數(shù)據(jù)Q20堿基比例超過(guò)95.6%，表明數(shù)據(jù)的質(zhì)量適合后續(xù)分析。對(duì)原始數(shù)據(jù)過(guò)濾，即去除含有帶接頭的、低質(zhì)量的序列，分別獲得21 228 708和22 748 744個(gè)有效讀長(zhǎng)(表 2)。使用Trinity將有效數(shù)據(jù)De novo組裝，獲得82 944個(gè)轉(zhuǎn)錄本。將轉(zhuǎn)錄本去除冗余后獲得40 877個(gè)unigenes。 unigenes中70.58%的長(zhǎng)度大于500 bp，43.63% 的長(zhǎng)度大于1000 bp，其長(zhǎng)度為301～31 819 bp，平均長(zhǎng)度為1218 bp(表3)。后續(xù)分析均以u(píng)nigenes序列作為參考序列。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

表3 De nove組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2 基因注釋

基于BLAST算法將unigenes基因序列分別于Nr、Nt、KOG、PFAM、SwissProt、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，取相似度>30%，且E<10-5的注釋，合并基因得到的所有注釋詳細(xì)信息，并統(tǒng)計(jì)各數(shù)據(jù)庫(kù)中unigenes基因注釋數(shù)量及百分比(表4)。對(duì)于7個(gè)主要的數(shù)據(jù)庫(kù)Nr、Nt、KOG、PFAM、SwissProt、GO和KEGG，其分別獲得61.97%、69.63%、23.00%、47.24%、53.48%、49.16%和35.82%的注釋，其中7691個(gè)unigenes在5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均有注釋(圖1)。

表4 基因注釋統(tǒng)計(jì)

圖1 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

GO是一套國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能描述的分類系統(tǒng)。基于轉(zhuǎn)錄本與Swissprot、TrEMBL的注釋結(jié)果，446 636個(gè)unigenes被分配到生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分中，其數(shù)量分別為297 873、52 533和96 230個(gè)(圖2)。基于基因知悉同源關(guān)系，使用KOG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步對(duì)功能進(jìn)行分類，9403個(gè)unigenes被分配到26個(gè)特定的KOG類別，其中信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制最多(1582個(gè)unigenes)，其次是一般功能預(yù)測(cè)基因(1476個(gè)unigenes)，翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及伴侶(993個(gè)unigenes)(圖3)。KEGG是系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物和化合物在細(xì)胞中的代謝途徑以及這些基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫(kù)。根據(jù)KO功能注釋與Pathway的聯(lián)系利用KAAS系統(tǒng)對(duì)13 580個(gè)unigenes進(jìn)行KEGG代謝通路分類，獲得34條通路途徑注釋。將34條通路分為5類(A～E)，其中unigenes的數(shù)量分別為3070、3147、1624、2977、和5160個(gè)(圖4)。

圖2 GO功能分類注釋

圖3 KOG功能分類注釋

圖4 KEGG分類注釋

2.3 表達(dá)差異分析

引入TPM計(jì)算樣品中基因表達(dá)豐度，根據(jù)表達(dá)豐度使用DEGseq軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析，并通過(guò)設(shè)置Q<0.05且∣Fold Change∣>2來(lái)篩選顯著差異基因。通過(guò)對(duì)對(duì)照組與瑞士乳桿菌HML037組比較，共鑒定出604個(gè)顯著差異基因，其中，326個(gè)基因顯著上調(diào)，278個(gè)基因顯著下調(diào)。比較兩組的基因表達(dá)水平(圖5)，橫坐標(biāo)表示基因在不同樣本中的表達(dá)倍數(shù)變化[log2(Fold Change)]，縱坐標(biāo)表示表達(dá)差異的顯著性水平[-log10(padj)]，上調(diào)基因用紅色點(diǎn)表示，下調(diào)基因用綠色點(diǎn)表示。在這些差異基因中，注釋到幾種與生長(zhǎng)和免疫相關(guān)的基因，如生長(zhǎng)素(GH)、胰島素生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGH-Ⅰ)、Toll樣受體、MyD88和主要組織相容性復(fù)合體-Ⅱ(MCH-Ⅱ)基因，具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及蛋白合成，抗腫瘤和抗病菌感染等功能。

圖5 差異基因表達(dá)水平

2.4 GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因富集分析

利用GO和KEGG富集技術(shù)進(jìn)一步分析差異基因，從而確定其潛在功能和代謝途徑。將差異基因映射到GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能富集分析，差異基因總共顯著富集到436個(gè)，顯著富集到5條通路中，其中生物過(guò)程包含0個(gè)，細(xì)胞組分包含1個(gè)，分子功能包含4個(gè)(圖6)。細(xì)胞成分功能類型中富集在氧化還原過(guò)程。分子功能富集在氧化還原酶活性、G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合、趨化因子活性和趨化因子受體結(jié)合。

圖6 GO功能富集分析

將差異基因映射到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路富集分析，當(dāng)矯正后的P值Q<0.05時(shí)，認(rèn)為該功能存在顯著富集情況，且Q值越小越顯著富集。結(jié)果顯示，26 545個(gè)差異表達(dá)基因總共富集到215條通路上，其中差異表達(dá)基因主要集中在核糖體、吞噬體、丙酮酸代謝、過(guò)氧化物酶體增殖激活受體信號(hào)通路、糖酵解/糖質(zhì)新生、脂肪酸延長(zhǎng)和脂肪消化和吸收，其中核糖體、丙酮酸代謝、脂肪酸延長(zhǎng)和脂肪消化吸收通路顯著富集(圖7)。

圖7 KEGG通路富集分析

2.5 qRT-PCR結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果的可靠性，通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證泥鰍9個(gè)重要功能基因的表達(dá)，即TRP、TMSB10、APC11、COLEC12、TNFRSF10、IL-10、IL-1B、FGL和IL-5。將對(duì)照組與瑞士乳桿菌HML037組的差異基因與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相比較(圖8)，結(jié)果顯示，被檢測(cè)的基因表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析結(jié)果基本一致，即證明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠。

圖8 功能基因qRT-PCR與轉(zhuǎn)錄組之間的相對(duì)表達(dá)水平

3 討 論

筆者通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析鑒定了泥鰍對(duì)瑞士乳桿菌HML037的應(yīng)答基因，為魚類的生長(zhǎng)和免疫機(jī)制的研究提供了分子模型。從對(duì)照組和瑞士乳桿菌HML037組共獲得 40 877個(gè)平均大小為1218 bp 的unigenes，且被注釋到公共蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中。RNA-seq結(jié)果的相關(guān)性分析表明RNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性和理論分析的可行性。

3.1 瑞士乳桿菌 HML037對(duì)泥鰍GO注釋的影響

GO注釋顯示，瑞士乳桿菌HML037組上調(diào)表達(dá)的基因明顯多于對(duì)照組。瑞士乳桿菌 HML037對(duì)泥鰍的氧化還原酶活性、G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合、趨化因子活性和趨化因子受體結(jié)合等影響顯著。根據(jù)表達(dá)方式和免疫系統(tǒng)中的作用，可以把趨化因子分為內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性趨化因子和炎性趨化因子，前者有維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的功能，對(duì)淋巴細(xì)胞歸巢、成熟起著重要作用；后者主要功能是募集效應(yīng)細(xì)胞，在協(xié)調(diào)先天免疫和獲得性免疫反應(yīng)中起重要作用[19]。趨化因子通過(guò)與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用，趨化因子受體屬G蛋白偶聯(lián)受體[20]。趨化因子首先作為趨化性介質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，但隨著對(duì)趨化因子研究的深入，他們不僅對(duì)白細(xì)胞具有趨化作用，在免疫細(xì)胞和器官的發(fā)育、免疫應(yīng)答過(guò)程、炎癥反應(yīng)、病原體感染、創(chuàng)傷修復(fù)及腫瘤形成和轉(zhuǎn)移等方面也發(fā)揮廣泛的生理和病理作用[21]。在對(duì)照組和瑞士乳桿菌HML037組的差異基因比較中顯示，Toll樣受體、MyD88和MCHⅡ等免疫相關(guān)基因均呈顯著上調(diào)。有研究表明，乳桿菌可以上調(diào)MHC、CD40或CD80基因的表達(dá)[22]。這與本研究結(jié)果相一致，表明瑞士乳桿菌HML037能夠激活Toll/MyD88和MCH信號(hào)通路，非特異性免疫應(yīng)答和免疫基因的表達(dá)很可能是因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)的激活增強(qiáng)，使其具有較高的免疫狀態(tài)，更好保護(hù)其被病原體入侵，減少養(yǎng)殖中抗生素使用的風(fēng)險(xiǎn)。

3.2 瑞士乳桿菌HML037對(duì)泥鰍KEGG通路的影響

KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中包含豐富的通路信息，這將有助于在系統(tǒng)水平去了解基因的生物學(xué)功能[23]。對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要集中在核糖體、吞噬體、丙酮酸代謝、過(guò)氧化物酶體增殖激活受體信號(hào)通路、糖酵解/糖質(zhì)新生、脂肪酸延長(zhǎng)和脂肪消化和吸收等過(guò)程。脂肪酸延長(zhǎng)酶是高不飽和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶之一，高不飽和脂肪酸是一類重要的生物學(xué)功能物質(zhì)，在魚類的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[24-26]。糖酵解是機(jī)體重要的糖代謝途徑，丙酮酸激酶是糖酵解過(guò)程中重要的限速和調(diào)節(jié)酶[27]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路可能是線粒體代謝和生長(zhǎng)在基因轉(zhuǎn)錄水平的共同調(diào)控通路[28]。此外，筆者篩選出了生長(zhǎng)素、胰島素生長(zhǎng)因子-Ⅰ、Δ6脂肪酸去飽和酶等重要的差異基因。胰島素生長(zhǎng)因子基因的表達(dá)增加，直接調(diào)控草魚(Ctenopharyngodonidella)肌肉的細(xì)胞分化，從而使其體質(zhì)量增加，生長(zhǎng)加快[29-31]。相關(guān)基因表達(dá)的增加，可能與泥鰍機(jī)體的蛋白質(zhì)合成、糖代謝和脂質(zhì)代謝呈正相關(guān)。這些基因表達(dá)增加表明，瑞士乳桿菌HML037具有調(diào)控生理功能的作用，從而使泥鰍的生長(zhǎng)加快和營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)引起的內(nèi)部應(yīng)答加快。但是，導(dǎo)致這些變化的分子機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步的科學(xué)研究。

4 結(jié) 論

測(cè)序獲得泥鰍的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，成為泥鰍轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的寶貴資源，也將有助于其他重要水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)品種的相關(guān)研究。飼料中添加瑞士乳桿菌HML037對(duì)泥鰍的生長(zhǎng)和免疫相關(guān)的基因和通路具有上調(diào)和激活作用，可能提高泥鰍的生長(zhǎng)速度和抗病力。由此可知，瑞士乳桿菌HML037在泥鰍養(yǎng)殖過(guò)程中可以替代抗生素的部分作用，減少抗生素的使用，進(jìn)而達(dá)到泥鰍健康養(yǎng)殖的目的。