基于網絡藥理學和體外研究探究瓜蔞薤白半夏湯治療動脈粥樣硬化的機制

馮 利,莊安琪,李軼維,王 月,楊 科

(1.國家開放大學醫藥學院,北京 100039；2.中國計量大學生命科學學院,浙江 杭州 310018)

動脈粥樣硬化是一種主要發生在大中型動脈的慢性疾病,以脂質的積累,平滑肌細胞的增殖,細胞凋亡、壞死和纖維化,以及局部炎癥為特征。動脈粥樣硬化可造成冠狀動脈狹窄,引起心肌梗死和心力衰竭；動脈粥樣硬化斑塊引起的動脈狹窄或破裂可導致腦部短暫性缺血、缺血性中風或出血性中風的發作。采用阿托伐他汀降血脂或阿司匹林抗血小板聚集是目前臨床上治療動脈粥樣硬化的常規方法。但因動脈粥樣硬化的發病機制十分復雜,這些方法并不能達到良好治療效果。中藥具有多成分、多靶點的特點,在防治動脈粥樣硬化方面具有自身獨特優勢,因此越來越受到人們的關注。

瓜蔞薤白半夏湯最早記載于《金匱要略》,主治痰盛瘀阻胸痹證。胸痹指胸部悶痛、喘息不得臥,即現代醫學上的冠狀動脈粥樣硬化相關疾病。已有文獻報道[1-2],瓜蔞薤白半夏湯聯合西藥治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心絞痛患者的總有效率可達96.77%,且可通過升高NO含量治療缺氧性肺動脈高壓。已有研究發現[3-7],瓜蔞薤白半夏湯對抗動脈粥樣硬化可能與抗炎、減輕氧化損傷、保護血管內皮、調節脂質代謝、降低病變動脈壁硫酸軟骨素蛋白聚糖、硫酸皮膚素蛋白聚糖含量有關。基于中藥多靶點、多通路的治療特點,瓜蔞薤白半夏湯治療動脈粥樣硬化的分子機制值得進一步探究。網絡藥理學整合了生物學、藥理學、計算生物學等多學科的相關知識,可從整體角度探討藥物與疾病的相關性,符合中醫學整體觀與辨證原則[8]。從網絡藥理學角度研究瓜蔞薤白半夏湯主要關注的疾病是冠心病[7,9]、慢性阻塞性肺病[10],其作用機制與其調節血小板活化及炎癥通路等相關。此外,還有未經試驗驗證的瓜蔞薤白半夏湯臨床治療器官定位和藥效成分預測[11]相關的研究。但是,盡我們最大所能,我們未檢索到基于網絡藥理學研究瓜蔞薤白半夏湯治療動脈粥樣硬化的相關研究報道。本研究旨在利用網絡藥理學的優勢與方法分析各目標點之間的潛在關系并構建網絡圖,探究瓜蔞薤白半夏湯治療動脈粥樣硬化的潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學研究

1.1.1瓜蔞薤白半夏湯化合物及靶點檢索 本研究以“瓜蔞”、“薤白”、“半夏”為檢索詞在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP,https：//tcmspw.com/tcmsp.php)中檢索瓜蔞薤白半夏湯的所有化學成分,然后以藥物口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug likeness,DL)≥0.18為篩選條件檢索相關化學成分及相應靶點。

1.1.2動脈粥樣硬化靶點檢索與篩選 以“Atherosclerosis”為檢索詞在OMIM(https：//omim.org/)、GeneCards(https：//www.genecards.org/)、DrugBank(https：//go.drugbank.com/)和TTD數據庫(http：//db.idrblab.net/ttd/)檢索并去重得到動脈粥樣硬化的相關靶點。

1.1.3瓜蔞薤白半夏湯與動脈粥樣硬化共同靶點篩選 將以上檢索得到的瓜蔞薤白半夏湯與動脈粥樣硬化的靶點上傳于Venn圖制作平臺(http：//www.ehbio.com/ImageGP/ index.php/Home/Index/VennDiagram.html)得到二者的交集靶點,即瓜蔞薤白半夏湯治療動脈粥樣硬化的潛在靶點。

1.1.4中藥-化合物-靶點-疾病網絡圖構建 利用Cytoscape 3.6.1軟件以三味中藥(瓜蔞、薤白、半夏)篩選得到的化合物分子、交集靶點以及動脈粥樣硬化為靶點,構建“中藥-化合物-靶點-疾病”網絡圖。

1.1.5蛋白相互作用圖構建 將瓜蔞薤白半夏湯與動脈粥樣硬化的交集靶點上傳至STRING數據庫(https：//string-db.org/)中,并將條件物種設置為“Homo sapiens”,最小相互作用分數設置為0.400 0。然后將獲得的蛋白相互作用圖導入Cytoscape 3.6.1軟件中利用Network Analyzer模型進行可視化分析。

1.1.6富集分析 將獲得的瓜蔞薤白半夏湯和動脈粥樣硬化共同靶點導入DAVID數據庫中(https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp),得到靶點相應的功能及在信號通路中的作用；限定物種條件為“Homo sapiens”,閾值設定為P<0.05,進行Gene ontology(GO)生物過程分析和Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)通路富集分析,并利用GraphPad prism 8.0繪制柱狀圖并在ImageGp平臺上(http：//www.ehbio.com/Cloud_Platform/front/)制作氣泡圖。

1.2 體外實驗驗證

1.2.1藥物與試劑 β-谷甾醇(B21972)購自上海源葉生物有限公司；氧化型低密度脂蛋白(XS20201007,Oxidized low-density lipoprotein, Ox-LDL)購自北京協生生物科技有限責任公司；白細胞介素-1β(EK0392,interleukin 1β,IL-1β)、白細胞介素-6(EK0410,interleukin 6,IL-6)和腫瘤壞死因子-α(EK0525,tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒購自Boster 生物技術公司；線粒體膜電位檢測試劑盒(C2006,JC-1)、吡咯烷二硫代甲酸銨鹽(S1808,Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)和噻唑藍溴化四唑(ST1537,MTT)購自碧云天生物技術有限公司；NF-κB抗體(10745-1-AP)、IL-1β抗體(16806-1-AP)、IL-6抗體(21865-1-AP)、TNF-α抗體(17590-1-AP)購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2.2細胞來源與培養 HAEC細胞購自美國ATCC細胞庫,細胞由含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液培養,并置于5% CO2、37 ℃培養箱中培養,取對數生長期細胞用于以下實驗。

1.2.3MTT法測定細胞活力 HAEC細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中,置于5% CO2、37 ℃培養箱中培養24 h后進行后續實驗。首先在Ox-LDL造模濃度實驗中,將細胞分為8組,分別加入0、40、50、60、70、80、90、100 mg·L-1的Ox-LDL,孵育24 h后移除細胞液并加入1 g·L-1的MTT溶液,孵育4 h后，加入100 μL的DMSO,然后,在570 nm波長下測定OD值。在β-谷甾醇毒性實驗中,將細胞分為6組,分別加入0、0.25、0.5、1、2、4 mg·L-1的β-谷甾醇,在5% CO2、37 ℃培養箱培養12 h后,采用上述Ox-LDL造模濃度實驗中所述方法,利用MTT溶液測定每孔細胞的OD值；在β-谷甾醇對細胞保護作用的實驗中,將細胞分為7組,Control、Model及5個β-谷甾醇組(0.25、0.5、1、2、4 mg·L-1),β-谷甾醇組預給藥不同濃度梯度的β-谷甾醇,孵育12 h后,除Control組外,其他組別均加入40 mg·L-1的Ox-LDL,最后,采用上述Ox-LDL造模濃度實驗中所述方法,測定細胞OD值。

1.2.4JC-1法測定細胞凋亡情況 將HAEC細胞接種于24孔板,分為Control、Model和β-谷甾醇組,當細胞處理結束后,移除細胞液,然后每孔加入1 mL的JC-1染色工作液,在37 ℃黑暗條件下孵育30 min,吸去上清,用JC-1染色緩沖液洗滌5次,并加入1 mL細胞培養液,最后在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.2.5酶聯免疫吸附測定細胞培養液中炎癥因子的表達 將HAEC細胞按照1×105個/孔的密度接種于24孔板,培養24 h后,將細胞分為Control、Model、β-谷甾醇組和PDTC組,然后按上述方法處理各組細胞,其中PDTC組細胞加入0.125 g·L-1的PDTC,孵育2 h后加入40 mg·L-1的Ox-LDL進行細胞造模；培養結束后,將細胞培養液收集于無菌EP管中,在1 000 r·min-1的條件下離心5 min后,移入新的EP管中備用,最后,根據ELISA試劑盒說明書所述的檢測步驟檢測細胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

1.2.6蛋白印跡法測定細胞內相關蛋白的表達 首先采用RIPA緩沖液提取細胞蛋白,使用BCA測定其蛋白濃度,然后用10%和8%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離蛋白并轉移至PVDF膜上,轉膜結束后在5%脫脂牛奶中封閉2 h,然后與p-NF-κB抗體(1 ∶1 000)、NF-κB抗體(1：1 000)、IL-1β抗體(1 ∶1 000)、IL-6抗體(1 ∶1 000)、TNF-α抗體(1 ∶1 000)在4 ℃條件下孵育過夜,次日,用PBS洗滌3次后與辣根過氧化物酶標記驢抗山羊IgG(H+L)孵育2 h,最后利用特超敏ECL化學發光試劑盒進行顯影觀察,并利用Image Lab軟件進行半定量分析。

2 結果

2.1 瓜蔞薤白半夏湯活性化合物通過TCMSP和BATMAN-TCM數據庫檢索到瓜蔞薤白半夏湯的化合物共293個,在OB≥30%和DL≥0.18的條件下篩選得到可用于分析的化合物30個,其中,瓜蔞、薤白、半夏分別有10、11和10個化合物分子,薤白和半夏有1個共同化合物分子(Tab 1)。

Tab 1 Active ingredients of Gualou Xiebai Banxia decoction

2.2 瓜蔞薤白半夏湯和動脈粥樣硬化共同靶點將上述獲得的瓜蔞薤白半夏湯的30個活性成分進行反向尋找得到136個對應靶點,在GeneCards、OMIM、TTD數據庫中檢索動脈粥樣硬化靶點,其中在GeneCards數據庫中得到780個靶點,OMIM數據庫中得到200個靶點,TTD數據庫中得到34個靶點,去重后得到803個靶點。將兩者的靶點制作成Venn圖后發現其共同靶點為78個,即瓜蔞薤白半夏湯治療動脈粥樣硬化有78個潛在靶點(Fig 1)。

Fig 1 Venn diagram of common targets of Gualou Xiebai

2.3 中藥-化合物-靶點-疾病網絡圖將瓜蔞薤白半夏湯和對應的30個活性化合物分子、78個交集靶點以及動脈粥樣硬化導入Cytoscape 3.6.1軟件中進行可視化分析(Fig 2)。由Fig 2可見,中藥-化合物-靶點-疾病網絡圖中共有112個節點(1種疾病、3味中藥、30個化合物活性分子、78個潛在靶點)。此外,瓜蔞薤白半夏湯的活性成分對應多個靶點,1個靶點也對應多個活性化合物分子,其中槲皮素(MOL000098,Quercetin)、豆甾醇(MOL000449,Stigmasterol)、β-谷甾醇(MOL000358,Beta-sitosterol)、卡文定堿(MOL002670,Cavidine)、黃芩素(MOL002714,Baicalein)分別對應52、16、15、14、12個活性靶點,而靶點PTGS2、PRKACA、ADRB2、PGR、SCN5A分別對應19、11、10、9、7個化合物分子。

Fig 2 Network diagram of TCM-compound-target-disease

2.4 蛋白相互作用網絡將瓜蔞薤白半夏湯和動脈粥樣硬化共同靶點制作為蛋白相互作用網絡圖(protein protein interaction,PPI)(Fig 3),發現IL-6、MAPK3、TP53、TNF、VEGFA、MAPK1的Degree值均在45以上(Degree：IL-6=52、MAPK3=51、TP53=48、TNF-α=47、VEGFA=46、MAPK1=46),且顯著高于其他靶點,以上靶點與炎癥通路、細胞凋亡和增殖等有密切關系。

Fig 3 Diagram of protein interaction network

2.5 GO富集分析為進一步探究瓜蔞薤白半夏湯治療動脈粥樣硬化的作用機制,將上述得到的共同靶點在DAVID數據庫中進行GO分析,結果共得到GO分析條目417條(P<0.05),其中229條生物過程(BP)條目、49條細胞組成(CC)條目、69條分子功能條目,分別占比54.92%、11.75%、16.55%,各類占比前10的條目如Fig 4所示,BP條目涉及到的有positive regulation of cell proliferation、oxidation-reduction process、apoptotic process等過程。這提示瓜蔞薤白半夏湯治療動脈粥樣硬化的靶點主要與細胞凋亡、細胞增殖、氧化和蛋白結合等有關。

Fig 4 Results of gene function GO enrichment analysis

KEGG通路富集分析得到14條相關信號通路,例如PI3K-Akt、MAPK、TNF等,并涉及IL-6、TNF等炎癥因子以及MAPK3、MAPK1等絲裂原活化蛋白激酶,這表明瓜蔞薤白半夏湯治療動脈粥樣硬化可能與抗炎、細胞凋亡等機制有密切關系(Fig 5)。

Fig 5 Results of gene KEGG pathway enrichment analysis

2.6 β-谷甾醇對Ox-LDL誘導的HAEC細胞凋亡的影響由中藥-化合物-靶點-疾病網絡圖(Fig 2)及Tab 1可知,槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、卡文定堿、黃芩素這幾種化合物是瓜蔞薤白半夏湯治療動脈粥樣硬化的主要的潛在活性分子。而上述物質中,槲皮素和黃芩素治療動脈粥樣硬化已有相關報道,豆甾醇、β-谷甾醇、卡文定堿未檢索到調控動脈粥樣硬化的報道,但有他們在調節脂質代謝、炎癥等基礎病理方面的相關報道。因此,我們初步選擇β-谷甾醇為研究對象來驗證我們網絡藥理實驗結果的正確性。Ox-LDL造模濃度實驗結果如Fig 6A所示,由Fig 6A可見,HAEC細胞活力在40～100 mg·L-1濃度梯度的Ox-LDL的作用下呈顯著下降趨勢,其中,在Ox-LDL濃度為40 mg·L-1時,細胞活力較control組明顯(P<0.05)降低,且大約為control組細胞活力的50%。因此,后續實驗選擇濃度為60 mg·L-1的Ox-LDL進行細胞造模。對β-谷甾醇的毒性研究發現,其濃度在0.25,0.5,1,2及4 mg·L-1時,HAEC細胞的活力無顯著變化(Fig 6B)。β-谷甾醇的細胞保護實驗結果如Fig 6C所示,與control組相比,模型組HAEC細胞活力明顯(P<0.01)下降,但濃度為1,2,4 mg·L-1的β-谷甾醇可以明顯(P<0.05,0.01,0.01)提高HAEC細胞的活力。利用JC-1熒光染色檢測細胞凋亡情況時發現,與control組細胞相比,模型組細胞的紅色熒光較強,綠色熒光較弱,而β-谷甾醇可以逆轉模型組細胞的上述趨勢(Fig 6D)。提示β-谷甾醇可阻止Ox-LDL誘導的細胞凋亡。

Fig 6 Effect of β-sitosterol on ox-LDL induced apoptosis of

2.7 β-谷甾醇對Ox-LDL誘導的HAEC細胞損傷的抗炎作用從蛋白相互作用網絡圖(Fig 3)可知,瓜蔞薤白半夏湯治療動脈粥樣硬化的靶點主要涉及IL-6、TNF-α等炎癥因子,因此對Ox-LDL誘導的HAEC細胞損傷的炎癥因子進行測定。結果發現(Fig 7),與control組相比,模型組細胞中的IL-1β、IL-6和TNF-α的含量明顯增高(P<0.01)；與模型組相比,β-谷甾醇組細胞中的IL-1β、IL-6和TNF-α的含量明顯降低(P<0.05,0.01),這說明β-谷甾醇可對抗Ox-LDL誘導的HAEC細胞損傷而發揮抗炎作用。

Fig 7 Anti-inflammatory effect of β-sitosterol on

2.8 β-谷甾醇對炎癥因子及其相關通路的影響對瓜蔞薤白半夏湯治療動脈粥樣硬化的靶點進行富集分析發現其主要涉及炎癥通路(Fig 5)。因此利用Western blot法對相關通路蛋白進行探測。結果顯示(Fig 8),與control組細胞相比,模型組細胞的p-NF-κB/NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平明顯增加(P<0.01),但在β-谷甾醇的作用后,HAEC細胞中p-NF-κB/NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α表達量明顯降低(P<0.05,0.01),這提示瓜蔞薤白湯可通過作用于炎癥通路治療動脈粥樣硬化。

Fig 8 Effects of β -sitosterol on inflammatory factors and NF-κB signaling n=4)

3 討論

動脈粥樣硬化在中醫雖無此名,但根據其臨床表現,醫家將其歸于“胸痹、中風”等范疇[12]。對于動脈粥樣硬化的病機各路醫家眾說紛紜,有學者認為毒邪可致臟腑功能紊亂,津液代謝失常,最終形成痰瘀痹阻血脈的病理狀態,從而形成動脈粥樣硬化。因此祛瘀化痰、清熱解毒為治療動脈粥樣硬化的治則之一。瓜蔞薤白半夏湯最早記載于《金匱要略》,是由蔞實、薤白和半夏三味中藥組成,方中,瓜蔞清熱滌痰、薤白行氣導滯、半夏燥濕化痰,三藥合用行通陽散結、清熱祛痰之效。現代藥理學研究亦表明,瓜蔞薤白半夏湯可通過調節脂質代謝、抑制氧化應激、減輕炎癥反應等有效延緩動脈粥樣硬化的進展[6]。中藥成分復雜、作用靶點多,其治療疾病的確切機制不容易闡明。網絡藥理學整合了生物學、藥理學、計算生物學等相關學科的知識,可從整體角度探討藥物與疾病的相關性,符合中醫學整體觀與辨證原則,有助于闡明中藥發揮藥效作用的機制。

從網絡藥理學角度研究瓜蔞薤白半夏湯主要關注的疾病是冠心病[7,9]、慢性阻塞性肺病[10],以及未經試驗驗證的瓜蔞薤白半夏湯臨床治療器官定位和藥效成分預測[11]等研究。本研究試圖從網絡藥理學角度探究瓜蔞薤白半夏湯治療動脈粥樣硬化的潛在作用機制。

本研究顯示,瓜蔞薤白半夏湯治療動脈粥樣硬化有30個活性化合物分子以及78個潛在治療靶點。張雯等[11]基于網絡藥理學分析了瓜蔞薤白半夏湯的藥效成分并得到了鄰苯二甲酸、甲基丁香酚等潛在化合物。本研究發現,β-谷甾醇作為半夏和薤白共有的活性化合物分子,可能是治療動脈粥樣硬化的潛在有效物質,其具有抗氧化、降脂、抗炎等藥理作用。大量研究表明,攝入富含β-谷甾醇的食物可降低低密度脂蛋白在血液中的濃度[13]。氧化型低密度脂蛋白是引起動脈粥樣硬化的危險因素之一,可誘導血管內皮細胞凋亡,繼而導致血管內膜增生、炎癥細胞浸潤、脂質沉積和斑塊破裂。因此抑制Ox-LDL誘導的血管內皮細胞凋亡是治療動脈粥樣硬化的重要手段。本研究中采用Ox-LDL誘導HAEC細胞損傷,發現β-谷甾醇可明顯降低Ox-LDL誘導的細胞凋亡。初步證明了β-谷甾醇是瓜蔞薤白半夏湯治療動脈粥樣硬化的藥效分子。

動脈粥樣硬化與LDL等脂蛋白在動脈內膜沉積,形成局部炎癥,炎癥招募單核細胞分化為巨噬細胞,巨噬細胞在攝取LDL后死亡、破裂有密切關系。本研究的蛋白網絡分析結果顯示,IL-6、TNF-α是瓜蔞薤白半夏湯治療動脈粥樣硬化的潛在靶點。IL-6是巨噬細胞和T細胞在炎癥早期產生的促炎因子,已有研究[14]顯示,抑制IL-6信號傳導可降低動脈粥樣硬化的發生風險。TNF-α的特異性單克隆抗體和抑制劑也可抑制動脈粥樣硬化的發展[15]。本研究發現,β-谷甾醇可明顯降低Ox-LDL誘導的IL-6及TNF水平升高。此外,研究發現[16],IL-1β在動脈粥樣硬化病變中的表達也明顯增高,被認為是臨床治療動脈粥樣硬化的潛在靶點,本研究證實了這一點,且β-谷甾醇也可明顯降低Ox-LDL誘導的升高的IL-1β水平。以上表明,瓜蔞薤白半夏湯可通過減輕炎癥導致的細胞損傷發揮治療動脈粥樣硬化的作用。

通過GO和KEGG分析證實,瓜蔞薤白半夏湯治療動脈粥樣硬化是通過多途徑、多方式介導。金宏飛等[7]利用網絡藥理學探討瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病的作用機制時發現,其機制主要與血小板活化通路、FoxO信號通路相關。NF-κB信號通路是調節上述炎癥因子的重要途徑,在動脈粥樣硬化的發病機制,炎癥和細胞死亡中發揮關鍵作用。Hajra等[17]研究發現,低密度脂蛋白受體(LDLR)-/-小鼠在長期喂食高脂飼料后,內皮細胞中NF-κB活性顯著增加,這導致了其動脈粥樣硬化的發生幾率增加。韋磊等[18]也證實,在高脂喂養ApoE-/-小鼠后,NF-κB磷酸化水平增加。本研究也發現,Ox-LDL可顯著升高p-NF-κB在HAEC細胞中的表達量,但β-谷甾醇可以明顯降低其活化水平。這進一步說明瓜蔞薤白半夏湯可通過抗炎作用治療動脈粥樣硬化,其分子機制可能與調控NF-κB信號通路有關。

綜上所述,瓜蔞薤白半夏湯可通過多靶點、多途徑治療動脈粥樣硬化。本研究結果初步顯示,β-谷甾醇是瓜蔞薤白半夏湯治療動脈粥樣硬化的活性藥效分子,其分子機制與調節抗炎、細胞凋亡信號通路有關。后續研究將進一步篩選其他潛在化合物以探究瓜蔞薤白半夏湯治療動脈粥樣硬化的其他可能機制。