大黃蟲丸調控ASIC1a/VEGF通路緩解肝纖維化

曹 銳，朱月琴，林慧敏，李洋洋，聞祥瑞，莫文汐，程欣然，吳 麗，黃 艷

[安徽醫科大學1.藥學院、2.重大自身免疫性疾病安徽省重點實驗室、3.炎癥免疫性疾病安徽省實驗室，安徽 合肥 230032；4.中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)藥劑科，安徽 合肥 230002；5.南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023]

肝纖維化是由多種病因引起的肝臟修復反應，主要表現為肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)的持續激活，以及細胞外基質(extra cellular matrix，ECM)的過度沉積[1]。其重要病理特征為肝內病理性血管的重構促進纖維間隔的產生，以及ECM過度沉積擠壓血管，導致氧氣輸送受阻[2]，肝臟局部產生低氧環境。HSC緊鄰肝竇內皮細胞，激活后可在缺氧誘導因子的參與下轉錄、分泌血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等血管生成因子，加強與肝竇內皮細胞旁分泌通訊，驅動病理性血管的產生，破壞肝臟結構，加劇肝臟病理性損傷[3]。

酸敏感離子通道(acid-sensitive ion channels，ASICs)是廣泛表達于細胞膜上的一類蛋白復合體，可感受胞外pH變化，通透陽離子。當胞外pH降低，ASICs通道開放，引起Ca2+、Na+內流，進而參與伴有缺氧和組織酸化的神經系統炎癥、腫瘤等病理進程中[4]。ASIC1a作為通透Ca2+的主要亞基，激活后開放通道介導Ca2+內流[5]。課題組前期研究表明[6]，在肝臟纖維化早期階段伴隨著炎癥反應和局部組織酸化，ASIC1a表達上調，通過介導PI3K/Akt和ERK通路的激活，引起HSC的增殖與活化，加速肝纖維化的進程。進一步研究發現[7]，活化的HSC中ASIC1a激活，介導Ca2+內流，促進鈣調素依賴蛋白激酶β(Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase kinase，CaMKKβ)活化并高表達。CaMKKβ是一種由Ca2+激活的酶蛋白，廣泛分布于肝臟和大腦，在炎癥、造血、血管生成等生理過程中具有重要作用。有研究顯示[8]，ASIC1a可通過促進大鼠滑膜成纖維細胞VEGF的釋放，調節大鼠滑膜血管翳的產生，進而參與大鼠關節炎的發展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 60只SPF級♂SD大鼠，體質量(200±20) g，購于鄭州市華興實驗動物養殖場，生產許可證編號：SCXK(豫)2019-0002，飼養于室內。溫度(25±2) ℃，濕度60%，通風良好。

1.1.2藥品與試劑 CCl4(汕頭西隴化工廠公司)；橄欖油(上海源葉公司)DHZCP(北京同仁堂公司，批號：國藥準字Z11021241)；秋水仙堿(西雙版納版納藥業公司，批號：國藥準字H53021369)；RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑 (上海碧云天公司)；Rabbit mAb anti-α-SMA、Rabbit mAb anti-VEGF、Rabbit mAb anti-Collagen-I、Rabbit mAb anti-β-actin (北京博奧森公司)；Rabbit mAb anti-ASIC1a(美國Affinity公司)；Rabbit mAb anti-CaMKKβ(武漢博士德公司)；TRIzol裂解液(湖南艾科瑞公司)；天冬氨酸轉氨酶(aminotransferase，ALT)、 丙氨酸轉氨酶(aspartate transaminase，AST)試劑盒(深圳邁瑞醫療器械公司)。

1.1.3主要儀器 Tissue-prp-03型組織破碎儀(上海凈信公司)；Western blot設備(美國Biorad公司)；4 ℃低溫冰箱 (青島海爾公司)；-20 ℃醫用低溫保存冰箱(安徽中科都菱)；-80 ℃醫用低溫保存箱(日本Panasonic)；、CFX Connect實時定量PCR儀(美國Biorad公司)、Microfuge 20R高速離心機(美國Beckman公司)。

1.2 方法

1.2.1分組及模型制備 60只雄性SD大鼠，隨機均分成6組：對照組(n=10)、模型組(n=10)、DHZCP低劑量組(n=10)、DHZCP中劑量組(n=10)、DHZCP高劑量組(n=10)、秋水仙堿組(n=10)。適應性飼養1周后，模型組及藥物處理組大鼠腹腔注射30%CCl4植物油混合溶液，每周2次，連續8周，對照組腹腔注射相同體積的植物油溶液。末次注射3d后，隔夜禁食，麻醉處死后取腹下腔靜脈血以及肝組織留存。

1.2.2DHZCP給藥方式 將DHZCP藥物磨成粉末狀，溶解于適量生理鹽水中。以成人60 kg體重折算等效劑量。DHZCP高劑量組(1 200 mg·kg-1); DHZCP 中劑量組(600 mg·kg-1); DHZCP低劑量組(300 mg·kg-1)；秋水仙堿組(0.2 mg·kg-1)。造模同時，不同劑量給藥組大鼠每天灌胃300、600、1 200 mg·kg-1的DHZCP，對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，連續8周。

1.2.3血清學指標檢測 大鼠麻醉后剖腹，腹部下腔靜脈取血，4 ℃、3 000×g，離心20 min，取上層血清，根據試劑盒的說明書測定AST、ALT。

1.2.4肝組織病理染色 取大鼠肝臟右葉相同位置組織，4%多聚甲醛固定2 d后，石蠟包埋，切片，HE、Masson染色法，封片，玻片掃描儀下觀察肝組織結構病理變化并拍照。

1.2.5免疫組化檢測肝組織中ASIC1a、α-SMA蛋白表達 對肝組織右葉標本進行染色，微波抗原修復。封閉，PBS液沖洗，滴加一抗，放置4 ℃冰箱過夜。洗脫后滴加二抗，室溫孵育1 h，DAB反應適量時間，流水沖洗，蘇木精復染，切片烘箱烤干，樹脂封片，鏡檢。

1.2.6q-PCR檢測肝組織中目的基因的表達 取30 mg大鼠肝組織，組織研磨儀中剪碎，加入1 mL TRIzol試劑提取總RNA。使用定量儀測定各組 RNA 濃度，并逆轉錄為cDNA。參照逆轉錄試劑盒說明書，以10 μL逆轉錄反應體系，進行以下程序擴增：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，87 ℃ 10 s;以此循環55次。以GAPDH 作為內參，2-ΔΔCt法計算各樣本ASIC1a、CaMKKβ、α-SMA、Collagen-I、VEGF的相對表達量，引物序列如Tab 1所示。

Tab 1 RNA primer sequence

1.2.7Western blot檢測肝組織中α-SMA、Collagen-I、ASIC1a、CaMKKβ、VEGF蛋白表達 切取30 mg大鼠肝組織，組織研磨儀中剪碎，加入1 mL含PMSF的RIPA裂解液提取總蛋白。根據BCA試劑盒對各組的蛋白濃度進行定量，調整蛋白濃度加入上樣緩沖液。進行SDS-PAGE電泳分離：80 V 30 min，120 V 60 min。電泳結束，采用濕轉200 mA恒流60 min轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。TBST清洗，加入一抗，4 ℃孵育過夜(孵育8 h以上)。次日，TBST清洗PVDF膜后，室溫下與山羊抗兔二抗孵育1 h。1 ∶1配制適量ECL顯影液，經化學成像系統成像，使用ImageJ軟件進行定量分析，將各蛋白條帶灰度值與內參β-actin比較，衡量各組蛋白的表達水平。

2 結果

2.1 各組大鼠血清ALT、AST水平變化如Fig 1顯示，模型組與對照組相比，血清ALT、AST水平均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，DHZCP高、中、低治療組和秋水仙堿治療組ALT含量(P<0. 05或P<0. 01)和AST含量(P<0.01)明顯降低，差異具有顯著性。

Fig 1 Serum ALT and AST levels of rats in each

2.2 各組大鼠肝組織病理學變化Fig 2所示，對照組大鼠肝細胞正常，排列整齊，肝組織結構完整。模型組肝組織結構嚴重破壞，肝細胞索排列異常，出現假小葉結構。肝細胞質中出現多個大小不等的圓形空泡，將核擠于一邊，此外細胞出現廣泛的脂肪變性，炎性壞死。Fig 2及Fig 3均顯示，模型組有明顯的纖維條索形成，膠原沉積明顯。而DHZCP各劑量治療組和秋水仙堿組相較于模型組肝細胞壞死及脂肪空泡明顯減少，纖維組織增生及纖維間隔的形成有所減輕。

Fig 2 HE staining results of rat liver tissues in each group (100×)

Fig 3 Masson staining results of rat liver tissues in each group(100×)

2.3 各組大鼠肝組織中ASIC1a 、α-SMA的表達免疫組化結果如Fig 4和Fig 5顯示，與對照組相比，模型組大鼠肝組織ASIC1a、α-SMA抗原陽性表達明顯增加，DHZCP處理組可明顯降低模型組大鼠肝組織ASIC1a、α-SMA表達水平，以中、高劑量組最為明顯，提示DHZCP治療肝纖維化的作用機制可能與調節ASIC1a的表達有關。

Fig 4 Immunohistochemistry of α-SMA in rat liver tissues of all groups(200×)

2.4 各組大鼠肝組織中ASIC1a、CaMKKβ、VEGF、α-SMA、Collagen-Ⅰ基因mRNA表達變化如Fig 6所示，模型組大鼠肝組織中ASIC1a、CaMKKβ、VEGF、α-SMA、Collagen-Ⅰ基因mRNA表達均高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，DHZCP低劑量組對ASIC1a、VEGF基因mRNA表達基本無影響，中、高劑量組ASIC1a、VEGF基因 mRNA的表達水平均有不同程度降低，差異具有統計學意義(P<0.01)。DHZCP低、中、高治療組CaMKKβ、α-SMA、Collagen-Ⅰ基因mRNA表達相較于模型組均有不同程度降低，差異具有統計學意義(P<0. 05或P<0. 01)。

Fig 6 Expression of ASIC1a，CaMKKβ，VEGF，α-SMA，Collagen-Ⅰ，mRNA in rat liver tissues of various

2.5 Western blot 法檢測各組大鼠肝組織 α-SMA、Collagen-Ⅰ、ASIC1a、CaMKKβ、VEGF蛋白表達變化如Fig 7所示，與對照組相比，模型組肝組織α-SMA、Collagen-Ⅰ蛋白表達明顯升高，差異具有統計學意義(P<0. 05或P<0. 01)。與模型組相比，低劑量組α-SMA蛋白表達水平基本一致，差異無統計學意義。中劑量組、高劑量組和秋水仙堿組α-SMA蛋白表達低于模型組，差異具有統計學意義(P<0. 05或P<0. 01)。與模型組相比，低劑量組和中劑量組Collagen-Ⅰ蛋白表達基本持平，不具有統計學差異，高劑量組和秋水仙堿組Collagen-Ⅰ蛋白表達下降，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果證實DHZCP對CCl4誘導的大鼠肝纖維化有明顯的治療作用。

Fig 7 Expression of α-SMA and Collagen-Ⅰprotein in rat liver tissues of different

Fig 8顯示，相較于對照組，模型組肝組織ASIC1a、CaMKKβ、VEGF蛋白表達明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，DHZCP不同劑量給藥組可呈劑量依賴性降低肝組織ASIC1a、CaMKKβ、VEGF的蛋白表達，差異具有統計學意義。(P<0.05或P<0.01)。

Fig 8 Expression of ASIC1a，CaMKKβ and VEGF protein in rat liver tissues of each

3 討論

肝纖維化的鮮明特征是HSC的活化和以α-SMA和Collagen-I為主要成分的細胞外基質的沉積[12]。多項研究指出，HSC的活化在肝內血管重構，肝纖維化進展中起關鍵作用。越來越多的證據顯示HSC活化所引起的細胞外基質的過度沉積，可壓迫肝內血管，造成氧氣輸送受阻，為HSC分泌及釋放促血管生成類因子如VEGF、血管生成素1(angiopoietin-1，Ang-1)等刺激病理性血管的生成創造缺氧前提[3]。同時，肝纖維條索、纖維間隔的產生可改變原有肝臟的小葉結構，常與新血管的生成并行，改變肝內血流流向，加重肝纖維化的病理性損傷。本實驗采用經典的CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型，血清ALT、AST結果及病理染色結果顯示，CCl4誘導的肝纖維化組大鼠肝組織損傷嚴重，肝纖維化模型成功復制，并伴有假小葉及纖維索條產生等現象。DHZCP低、中、高治療組肝纖維條索及假小葉結構均有不同程度減少，劑量依賴性降低血清ALT、AST水平，表明DHZCP可緩解CCl4誘導的肝臟病理性損傷，對肝纖維化有明顯的治療作用。

以往的研究多認為，缺氧是誘導VEGF表達的主要原因。低氧誘導因子HIF-1α可上調VEGF的表達促進腫瘤疾病中的血管增生[13]。另有研究發現[14]，抑制ASIC1a表達及活性后，可減輕缺氧所致的神經元損傷。如之前所述，缺氧、局部組織酸化是肝纖維化前期階段炎癥反應的常見現象，炎癥、缺氧不僅為增強ASIC1a的表達及活性創造了條件，也為ASIC1a參與肝組織VEGF表達及血管重構這一觀點提供了一定的理論依據。課題組在前期研究發現[15]，CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型中，ASIC1a表達顯著增加。體外研究顯示，HSC活化后，ASIC1a表達及通道活性增加，Ca2+內流增多[5]。Ca2+作為重要的細胞信使，參與了胞間信息傳遞及包括血管生成在內的多種生理進程。進一步研究發現，ASIC1a可調節HSC中CaMKKβ/ERK通路，誘導HSC自噬發揮促纖維化作用[7]。CaMKKβ與Ca2+聯系緊密，且研究已表明，CaMKKβ可上調強有效的促纖維化因子VEGF的表達水平，影響組織血管生成[16]。這表明：一方面ASIC1a的表達及活性上調與肝纖維化的發生發展密切相關，另一方面ASIC1a可能是調節VEGF釋放、血管重構的重要環節。基于此，本實驗探究了DHZCP對肝纖維化大鼠的治療作用及其ASIC1a/VEGF相關機制。

本研究結果顯示，模型組ASIC1a及VEGF蛋白與mRNA水平明顯上升，DHZCP治療組能夠有效逆轉ASIC1a 、VEGF蛋白水平的上調。此外，肝纖維化標志物α-SMA和Collagen-I的表達也隨DHZCP劑量升高而逐漸降低，并與ASIC1a 、VEGF的表達變化呈相似趨勢，進一步證實了DHZCP發揮治療肝纖維化的作用可能與調控ASIC1a/VEGF的表達有關。中藥因其循證、多組分、多渠道、多環節的綜合治療作用，在醫治肝病方面可發揮獨特的作用。既往研究指出[17]本方含有多種“活血化瘀”藥味成分如大黃、地黃、水蛭等，且君藥大黃中所富含的黃酮類物質如大黃酸、大黃素、大黃酚等，均可抑制血管生成類蛋白表達。但由于中藥復方成分復雜，藥味間不同配伍可產生不同的治療作用，傳統藥理學方法不足以解釋復方中所起效單體成分。因此，ASIC1a如何調控VEGF表達及DHZCP復方單體成分的篩選和機制仍需后續實驗深入研究。

綜上所述，DHZCP可緩解CCl4誘導的大鼠肝纖維化，其機制可能與調控ASIC1a/VEGF通路有關。后續將在體外分子水平上篩選DHZCP的活性成分，更加深入細致的研究肝纖維化、ASIC1a和VEGF間的聯系。實驗的研究結果將為纖維化的治療和新的藥物靶點篩選提供新的思路和依據。