基于TLR4/NF-κB/MyD88通路探討清解化攻方抑制雨蛙素誘導重癥急性胰腺炎模型大鼠炎癥反應的生信分析及實驗驗證

秦百君,唐曦平,楊 昕,卜獻忠,宮文浩,陳月橋,陳國忠

(1.廣西中醫藥大學,廣西 南寧 530001；2.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院,廣西 南寧 530021；廣西中醫藥大學第一附屬醫院,廣西 南寧 530023)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是多種病因引起的胰蛋白酶異常激活、胰腺組織水腫壞死及炎癥介質大量釋放,繼發全身炎癥性反應綜合征和多器官功能障礙綜合征的急危重癥,包括中國在內的亞洲國家本病發病率約(36～125)/10萬人,在急性胰腺炎患病人數中占比約20%,死亡率可達6.5%～26%,患病進展迅速,預后兇險[1-3]。SAP發病機制十分復雜,其中“炎癥介質與細胞因子學說”在闡述SAP發病進展過程具有重要地位,由于胰腺腺泡細胞內廣泛的酶激活現象能夠促使腺體自溶、細胞壞死,從而釋放大量炎癥介質與細胞因子入血,進而引起氧自由基產生和血管損傷,級聯式炎癥反應加重多器官損傷[4]。而TLR4/NF-kB/MyD88信號通路是關鍵的炎癥轉導途徑之一,可調控多種炎癥介質和細胞因子的表達,該通路活化在SAP發病過程中發揮重要作用[5]。

清解化攻方(QingJieHuaGong decoction, QJHGD)是廣西中醫藥大學第一附屬醫院治療SAP名醫驗方的院內制劑,已在我院及醫聯體合作單位使用多年,臨床療效顯著[6],目前復方已獲得國家發明專利(專利號：ZL201811021893.2)。課題組前期實驗證明QJHGD對SAP大鼠可減少胰腺出血、降低壞死程度,減輕炎癥細胞浸潤,但具體機制未明。本研究結合生信數據分析,構建QJHGD調控網絡并富集相關信號通路,通過雨蛙素聯合脂多糖(caerulein-lipopolysaccharide,CAE-Lps)復制SAP大鼠模型,揭示QJHGD通過調控TLR4/NF-κB/MyD88信號通路從而發揮抑制炎癥反應、緩解胰腺炎病情的作用。

1 材料與方法

1.1 QJHGD網絡藥理學預測

1.1.1在線數據庫及分析軟件 中藥成分數據庫TCMSP(http：//tcmspw.com/tcmsp.php及https：//www.tcmsp-e.com)、TCMID(http：//www.megabionet.org/tcmid/);藥物靶點數據庫BATMAN TCM (http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、Pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、swiss target prediction(http：//www.swisstargetprediction.ch/);疾病數據庫GeneCards(www.genecards.org/)、TTD(http：//db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(https：//omim.org/)、pharmgkb(www.pharmgkb.org/)、Drugbank(https：//go.drugbank.com/)。蛋白互作用String數據庫(https：//string-db.org/)、蛋白數據庫Uniprot(https：//www.uniprot.org)?；蚬δ茏⑨尵W站Metascape(https：//metascape.org/)。作圖工具Cytoscape 3.7.1、yihanbo網站(http：//www.ehbio.com/ImageGP/index.php/)。

1.1.2QJHGD活性成分及靶點篩選 利用TCMSP、TCMID數據庫檢索QJHGD中柴胡、大黃、厚樸、黃芩、木香、桃仁、枳實7味中藥的化學成分,篩選條件滿足“Lipinski類藥原則”,且藥物相似度DL≥0.18、口服生物利用度OB≥30%、Caco-2細胞表觀滲透系數≥-0.4。刪除人工檢索無文獻支撐的化合物,結合參考文獻及PubChem數據庫結果,將沒有滿足藥動學參數化合物去掉,最終保留QJHGD有效成分。篩選后的活性成分結合Pubchem、swiss target prediction逐一配對潛在藥物作用靶點,綜合BATMAN TCM數據庫結果,得到QJHGD作用靶點集合。gene symbol通過UniProt數據庫注釋。

1.1.3SAP疾病相關靶點篩選 以“Severe acute pancreatitis”為關鍵詞,綜合GeneCards、TTD、OMIM、pharmgkb、Drugbank數據庫收集SAP相關疾病靶點,將QJHGD作用靶點集合與SAP疾病靶點交互映射,以交集韋恩圖形式展示QJHGD干預SAP的相關靶點集。

1.1.4蛋白互作用網絡構建 將交集靶點輸入String網站,構建蛋白質互作用網絡圖。選擇“Muitiple proteins”,物種“Homo sapiens”,置信度設置為>0.90。

1.1.5“藥物-成分-靶點”網絡構建 藥物有效成分與QJHGD干預SAP的靶點集相互映射,成分靶點逐一匹配,借助Cytoscape 3.7.1軟件繪制QJHGD干預SAP的“藥物-成分-靶點”網絡圖。

1.1.6GO和KEGG富集分析 Metascape數據庫對核心靶點進行基因本體論(GO)功能富集和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析,P<0.05。選擇富集數目最多的前20個條目在yihanbo網站分別繪制GO和KEGG氣泡圖。

1.2 CAE-Lps誘導SAP模型大鼠體內實驗驗證

1.2.1動物 6～8周齡♂ SPF級SD大鼠40只,體質量(200±20) g,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,生產許可證號：SCXK(湘)2019-0004。大鼠于廣西中醫藥大學SPF級實驗室飼養[SYXK(湘)2019-0001],飼養條件：濕度55%～65%、溫度(24±2)℃、光暗循環12 h·d-1。實驗所涉及動物飼養符合福利標準。

1.2.2藥品與試劑 QJHGD實驗處方：柴胡、大黃、厚樸、黃芩、木香、桃仁、枳實,由廣西中醫藥大學一附院煎藥室制備,廣西中醫藥大學中藥資源中心鑒定藥材符合《中華人民共和國藥典》規定。藥材加10倍蒸餾水浸泡24 h,先武火煮沸,后文火繼續煮30 min,濾出藥液常法下煎煮3次,過濾藥液用旋轉蒸發儀濃縮,配制1 kg·L-1生藥。注射用烏司他丁(規格2 mL：10萬IU,廣東天普洛安生物,貨號031905103)。Elisa試劑：大鼠α-AMS(賽默飛DG96286Q-96T)、大鼠脂肪酶(賽默飛DG96276Q-96T)、大鼠IL-6(武漢云克隆L210405259)、大鼠TNF-α(上海酶聯m1064303-C)等試劑盒。免疫組化試劑：蘇木素-伊紅染色試劑盒(索萊寶,貨號G1120),DAB顯色試劑盒(中杉金橋,貨號ZLI-9018),TLR4一抗(賽默飛,貨號13-9924-81),NF-κB P65一抗(賽默飛,貨號PA5-27617),MyD88一抗(賽默飛,貨號PA5-19918),二抗通用二步法檢測試劑盒(大鼠增強聚合物法檢測系統,貨號PV-9000)。雨蛙素(上海源葉生物,貨號S62702),脂多糖(上海源葉生物,貨號S11060)。

1.2.3儀器 Centrifuge5804R離心機(德國艾本德)；ThermoFisher Multiskan GO全波長酶標儀(美國賽默飛)；ZKPJ-1A烤片機(天津愛華);Histostar組織包埋機(美國賽默飛)；ASP300S封閉式組織脫水機(德國徠卡)；Coverslipper CS500全自動智能染色封片一體機(中國達科為)；電子顯微鏡(德國徠卡)。

1.2.4動物造模 SD大鼠適應性喂養1周后,隨機分為正常組、模型組、中藥組、西藥組,每組各10只,造模前24 h禁食不禁水。造模采用雨蛙素注射法[7],將雨蛙素用DMSO溶解后予0.9%生理鹽水稀釋成5 mg·L-1,參考《藥理實驗方法學》[8],根據臨床體重折算,模型組及各給藥組大鼠予50 μg·kg-1CAE腹腔注射,每小時注射1次,連續6次,第7次注射LPS 10 mg·kg-1復制SAP模型。注射結束后,中藥組予QJHGD溶液灌胃7 g·kg-1(等同于臨床等效劑量,且該劑量為前期實驗確定最佳劑量故未設量效組別),正常組、模型組予相同容積生理鹽水灌胃,西藥組予烏司他丁皮下注射,按臨床用量折算為2萬IU·kg-1,每天2次,連續3 d。給藥完成后,予腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg·kg-1麻醉。

1.2.5QJHGD對SAP大鼠血清淀粉酶、血清脂肪酶活性及炎癥因子表達水平的影響 取材時充分暴露腹主動脈,置入套管針采血,留取血液標本,留取的血液標本在室溫下放置2 h,然后在4 ℃下高速離心機以3 500 r·min-1離心10 min,取上層血清分裝于試管中。采用酶聯免疫吸附實驗用酶標儀在450 nm波長下檢測各組血清淀粉酶、血清脂肪酶、IL-6、TNF-α的OD值,繪制樣品標準曲線并換算濃度。

1.2.6蘇木精-伊紅染色法觀察QJHGD對SAP大鼠胰腺組織病理改變的影響 胰腺體部位取材,4%多聚甲醛固定,后石蠟包埋切片,予37 ℃恒溫箱烤片1 h,二甲苯和無水乙醇脫蠟水化。切片經蘇木精染色液染色5 min,分化液分化后予自來水浸泡,后將切片置于伊紅染液1 min,自來水洗凈切片,最后予脫水、透明、封片,鏡下觀察包含QJHGD中藥組在內的各組SAP大鼠胰腺組織病理改變情況。

1.2.7免疫組化法檢測胰腺組織TLR4/NF-kB/MyD88通路關鍵蛋白表達 石蠟切片于65 ℃烤片后予檸檬酸鈉修復液浸泡并機器高壓(100 ℃,100 kPa)修復1 h,阻斷封閉之后,根據抗體說明書將抗體按1 ∶100比例稀釋,孵育TLR4、NF-κB、MyD88一抗,存放在濕盒中4 ℃冰箱過夜。24 h后取出PBS洗滌3次,二抗滴片,孵育20 min后,洗凈加入DAB顯色液,后予蘇木精復染轉藍,脫水、封片。Image pro plus6軟件分析并計算平均光密度,測算方法參考李楓等[9]文獻。

2 結果

2.1 網絡藥理學預測QJHGD防治SAP的成分及靶點

2.1.1QJHGD有效成分篩選及作用靶點預測 在TCMSP、TCMID數據庫共收集到QJHGD成分1 415種,刪除重復化合物,滿足類藥性DL、口服生物利用度OB、Caco-2細胞模型條件及Lipinski類藥原則,選擇具有良好ADME特性的化合物,并去除人工檢索無文獻支撐的成分。重新納入文獻研究中槲皮素(quercetin)、橙皮苷(hesperidin)等滿足藥動學參數條件的藥效分子。最終確定Sainfuran、aloe-emodin、Magnolol等QJHGD有效成分105種化合物,其中柴胡13種、大黃10種,厚樸8種,黃芩32種,木香5種,桃仁18種,枳實19種,部分成分見Tab 1。篩選后的活性成分結合Pubchem、Swiss target prediction逐一配對潛在藥物作用靶點,綜合BATMAN TCM數據庫結果,得到QJHGD作用靶點189種。

Tab 1 Information of main active ingredients in QJHGD*

2.1.2SAP疾病相關靶點 通過對GeneCards、TTD、OMIM、pharmgkb、Drugbank數據庫逐一檢索,分別收集到SAP相關靶點個數為6 989、12、147、121、12。5個數據集取并集后共得到SAP相關靶基因個數7 039。各數據集之間映射情況如Fig 1所示。

Fig 1 Vertical Venn diagram of SAP target gene

2.1.3QJHGD防治SAP重要靶點及蛋白互作用網絡 QJHGD干預的189個中藥靶點和7 039個SAP疾病相關靶點取交集后,得到QJHGD防治SAP的共同作用靶點167個,見Fig 2。在String網站輸入該共同靶點集合,刪除無效靶點后,得到124個重要靶點集合,見Fig 3。

Fig 2 Venn diagram on intersection genes of QJHGD-SAP

Fig 3 PPI network of QJHGD in treatment of severe acute pancreatitis

2.1.4QJHGD防治SAP的“中藥-成分-靶點”調控網絡 105種QJHGD中藥有效成分和124個SAP疾病重要靶點輸入Cytoscape繪制“藥物-成分-靶點”網絡圖,該網絡中含有318個節點和1 167條邊。菱形代表疾病靶點,圓形代表中藥成分,不同顏色的圓形節點代表不同的中藥,體現了QJHGD多成分、多靶點、多途徑防治SAP的特點,見Fig 4。其中,TLR4、NF-κB、Myd88靶點被柴胡、枳實、大黃、木香、黃芩、厚樸的中藥有效成分交叉映射。Toll樣受體4信號傳遞蛋白(Toll-like receptor4,TLR4)是炎癥級聯反應的門戶啟動蛋白,在SAP胰腺腺泡細胞和腸黏膜上皮細胞均有廣泛分布；核轉錄因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)被認為是SAP瀑布級聯反應上游靶點,可上調免疫炎性相關的趨化因子、黏附因子表達,促成炎癥反應不斷放大加重器官損害；髓樣分化蛋白88(myeloid differentiation factor88,MyD88)作為Toll通路下游重要的接頭蛋白,在炎癥免疫通路中發揮關鍵作用。上述3個靶點可能是QJHGD拮抗SAP炎癥反應發揮調控作用的途徑之一。

Fig 4 Network diagram on “TCM - component - target” of QJHGD

2.1.5GO和KEGG富集分析 QJHGD防治SAP重要靶點輸入Metascape進行功能和通路富集分析。GO富集分析得到生物過程條目1 814、細胞組分條目94個、分子功能條目172個。生物過程包含脂多糖反應、細胞對有機環化合物反應等過程；細胞組分涉及細胞質的核周區、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物等；分子功能包括轉錄因子結合、G蛋白偶聯胺受體激活等,見Fig 5。KEGG通路富集分析,共富集到320條不同通路,其中Fig 6所示,Toll樣受體經典通路與NF-κB通路為本研究關注的靶向通路。通路富集分析也進一步驗證和揭示QJHGD可能通過調控Toll樣受體、NF-κB經典通路從而發揮防治SAP作用,富集結果與中藥作用的重要靶點相契合。后續動物實驗圍繞TLR4/NF-kB/MyD88通路蛋白表達情況進行驗證。

Fig 5 GO biological function enrichment analysis

Fig 6 KEGG pathway enrichment analysis

2.2 動物模型體內實驗驗證

2.2.1QJHGD對SAP大鼠血清淀粉酶、脂肪酶活性及IL-6、TNF-α含量的影響 相比于正常組,模型組大鼠血清中的淀粉酶、脂肪酶活性均升高(P<0.05)；中藥組和西藥組兩者水平較模型組低(P<0.05)；中藥組與西藥組相比,血清淀粉酶活性降低,血清脂肪酶活性表達差異不明顯。模型組大鼠TNF-α、IL-6含量較正常組、各給藥組比較均升高(P<0.05)；中藥組IL-6含量明顯低于模型組(P<0.05)。上述結果說明QJHGD可有效降低SAP模型大鼠血清淀粉酶、脂肪酶、IL-6、TNF-α表達水平,抑制大鼠炎癥反應(Fig 7)。

Fig 7 Effect of QJHGD on expression of inflammatory factors in SAP n=6)

2.2.2QJHGD對SAP大鼠胰腺組織病理的影響 SAP模型大鼠胰腺組織病理檢查顯示,正常組大鼠胰腺小葉、腺泡結構均正常,組織結構縝密,未出現明顯的水腫、充血、炎性浸潤；模型組部分區域胰腺腺泡萎縮,炎細胞浸潤,組織水腫及顯著空泡樣改變；中藥組和西藥組中胰腺腺泡結構大部分尚存,僅見少量壞死及輕度水腫(Fig 8)。

Fig 8 Effect of QJHGD on pancreatic pathology in SAP model rats(HE staining, ×200)

2.2.3QJHGD對SAP大鼠胰腺TLR4/NF-kB/MyD88信號通路的影響 正常組胰腺組織結構完整,TLR4 、NF-κB、MyD88陽性表達尚淺；模型組可見大量胞質TLR4、NF-κB陽性染色細胞和胞核MyD88陽性染色細胞；與正常組相比,模型組TLR4、NF-κB、MyD88表達均增高(P<0.05),陽性表達區域明顯增多。中藥組腺泡結構基本完整,TLR4、NF-κB、MyD88陽性染色細胞較模型組和西藥組明顯減少；與西藥組相比,中藥組TLR4、NF-κB陽性表達明顯降低(P<0.05),中藥組MyD88陽性表達差異不明顯(P<0.05)(Fig 9-10)。

Fig 9 Expression of TLR4, NF-κB and Myd88 in pancreatic of mice in each group(immunohistochemical method ×200)

Fig 10 IOD value of TLR4, NF-κB and Myd88 in pancreatic tissues of each group of n=6)

3 討論

重癥急性胰腺炎是急性胰腺炎伴有持續性臟器功能障礙、全身炎癥反應綜合征、多器官功能衰竭的臨床常見急危重癥。在SAP早期及時予不同治療手段干預,如中藥鼻飼、灌腸、外敷等,中西醫結合多途徑緩解病情十分重要。中醫理論認為本病屬于濕熱瘀濁絞結于中焦及腸道,日久成毒,耗氣傷陰,治療上當“清熱化濕解毒、化瘀攻下存陰”并舉[10]。清解化攻方是遵從上述治則,長期廣泛使用確有療效的臨床協定處方,該方由柴胡等7味中藥精心組合,以通腑瀉濁的小承氣湯為基礎,配理氣化濕、活血祛瘀、清熱解毒藥共奏蕩滌毒邪、存陰護陽的作用。清解化攻方臨床療效確切,但作用靶點、通路機制等尚不明確。本研究結合網絡藥理學和分子生物學方法,探究清解化攻方治療重癥急性胰腺炎的作用機制。

Fig 11 Schematic diagram of QJHGD inhibiting

網絡藥理學多數據庫收集清解化攻方化學成分,篩選滿足Lipinski類藥原則且藥物相似度DL≥0.18、口服生物利用度OB≥30%、Caco-2細胞表觀滲透系數≥-0.4要求,結合PubChem數據庫,最終保留QJHGD有效成分105種。清解化攻方中柴胡的主要成分柴胡皂苷是天然的皂苷類化合物,有抗炎、調節免疫、促酶分泌等作用,雷霏等[11]報道柴胡皂苷可通過抑制c-fos、c-jun mRNA及蛋白表達改善胰腺炎大鼠胰腺外分泌功能,進而抑制胰腺酶蛋白過度合成抑制胰腺炎病情進展。大黃中主要成分為蒽醌類中的大黃素、大黃酸,可調節血脂、抗血小板聚集、抗氧化和免疫調節等,伍洋等[12]研究表明，TLR4高表達促進炎癥反應進程,大黃素可通過下調TLR4等免疫因子的表達,恢復Treg/Th17免疫平衡,緩解SAP炎癥反應；蔡丹莉等[13]通過開腹胰膽管注射?；悄懰徕c復制SAP動物模型,也證實了大黃素可調節大鼠胰腺及肺組織Toll樣受體4水平從而發揮抗炎作用。厚樸酚有抗炎抗菌、抗病原微生物,抗潰瘍,抗氧化,抗腫瘤等作用,王燕等[14]研究表明，厚樸酚可抑制HMGB1-TLR4/NF-κB信號轉導通路,降低炎癥因子水平,緩解SAP及SAP相關肺損傷病情；另外,厚樸多酚清除氧自由基、改善微循環血流灌注對于緩解胰腺炎病情也發揮重要作用。黃芩苷是中藥黃芩的主要有效成分,Jingmin等[15]報道了黃芩苷可抑制胰腺組織中NF-κB表達,減輕胰腺炎癥反應,這與枳實的有效成分皂苷可抑制胰酶活性發揮抗炎作用類似。木香包含萜類、黃酮等多種成分,木香烴內酯作為其活性成分之一,可有效抑制脂多糖誘導的NO產生和NF-κB活化,抑制誘導型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表達發揮抗炎作用[16]。蘭濤等[17]報道了桃仁提取物可顯著降低SAP大鼠TLR4和NF-κB p65的mRNA水平改善其免疫功能。上述實驗及文獻研究表明,清解化攻方中藥的主要組分在抑制胰腺炎炎癥反應、調節TLR4/NF-κB p65通路表達方面具有重要作用。

通過網絡藥理學GO和KEGG富集分析,結果表明清解化攻方防治SAP的生物學過程包括對無機物質響應、脂多糖反應、與轉錄因子結合等,交集靶點涉及PI3K-Akt、Toll樣受體、NF-κB等經典信號通路。SAP炎癥發生與模式識別受體識別病原相關分子模式,引發機體免疫應答、同時釋放炎癥介質相關。Toll樣受體家族作為重要的炎癥識別受體,該類跨膜蛋白能識別受體及復合物的胞外區域,從而激發下游分子通路。TLR4是最早被發現的I型跨膜蛋白受體,其胞內區的TIR結構域可與接頭蛋白Myd88死亡結構域和中間域相結合,募集并分離集白介素受體相關激酶(IL-receptor-associated kinase,IRAK),與腫瘤壞死因子受體結合后激活下游通路的NF-κB誘導激酶((NF-κB inducing kinase,NIK),活化NIK進一步激活IκB激酶,后者通過與NF-κB復合物解聚,暴露核序列從而激發核轉錄因子途徑,導致炎癥反應和免疫應答[18]。在本研究動物實驗中,通過腹腔注射雨蛙素和脂多糖復制SAP大鼠模型,該方法相比膽胰管逆行注射?；悄懰徕c操作易行,造模成功率高,可穩定復制SAP模型。實驗結果顯示，模型組大鼠的血清淀粉酶、血清脂肪酶、IL-6、TNF-α活性較正常組相比均明顯升高,胰腺組織部分區域胰腺腺泡萎縮,炎細胞浸潤,組織空泡樣病變,TLR4通路活化,NF-κB p65、MyD88蛋白的陽性表達明顯升高；中藥組大鼠血清中的淀粉酶、脂肪酶、IL-6、TNF-α等炎癥因子表達水平明顯降低,胰腺結構基本完整,無明顯水腫充血,TLR4表達下調,NF-κB p65活化抑制,MyD88蛋白陽性表達降低。結果說明清解化攻方可通過下調TLR4/NF-kB/MyD88信號通路發揮抑制SAP大鼠炎癥反應的作用,該結果與網絡藥理學KEGG富集的靶向信號通路相契合。

綜上,本研究利用網絡藥理學生信數據分析,并通過雨蛙素聯合脂多糖復制大鼠疾病模型,在體內實驗驗證了清解化攻方改善重癥急性胰腺炎大鼠胰腺損傷的作用機制之一,可能與通過下調TLR4/NF-κB/MyD88通路關鍵蛋白表達相關,機制示意圖見Fig 11。