非水溶性樣品用的細菌內毒素標準品的研制

裴宇盛，陳 晨，趙小燕，高 華，蔡 彤

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

新型制劑及其所用的輔料(膽固醇、蛋黃卵磷脂、乙膠脂丙膠脂共聚物等)多不溶于水，需采用非水性溶劑溶解，如無水乙醇、二甲基亞砜等。但在進行內毒素的檢測研究過程中，關鍵一步為供試品陽性對照(回收試驗)的制備，即向供試品中添加細菌內毒素標準物質。由于目前國內外的細菌內毒素標準品中均含有聚乙二醇和乳糖等水溶性賦形劑[1-3]，不能溶于非水溶性溶劑，尤其聚乙二醇具有一定表面活性，當遇到非水溶性溶劑時會在萃取、稀釋等過程中會出現乳化現象，最終使檢驗無法進行[4-6]。

因此，需制備一批專用的細菌內毒素標準品，用于新型制劑及其輔料等非水溶性藥品的內毒素檢測，即細菌內毒素國家標準品(非水溶性樣品用)。

1 材料與方法

1.1 儀器Synergy HT型多功能酶標儀(美國Biotek公司)；Multireax型旋渦混合器(德國Heidolph)；WNE45型恒溫水浴(德國Memmert公司)；BET-72型內毒素測定儀(天大天發科技有限公司)MultiFlo FX型多功能微孔板分液器(美國Biotek公司)。

1.2 試劑細菌內毒素精品原料，購于SIGMA公司，批號：024M4019V，該批原料是使用酚水法從菌號為O111B4的大腸桿菌中提取制備得到，生物效價為4×109EU·g-1，由中國食品藥品檢定研究院分裝為1 mg/支。細菌內毒素國家標準品，中國食品藥品檢定研究院，批號：150800-201601。細菌內毒素檢查用水：購于湛江安度斯生物有限公司，貨號：W-050。鱟試劑：購于湛江安度斯生物有限公司；廈門鱟試劑生物科技股份有限公司；湛江博康海洋生物有限公司；福州新北生化有限公司。

1.3 標準品候選品的凍干制備共制備2批標準品候選品。分別于2018年1月24日生產了1批候選品，編號為A；于2018年4月18日生產了1批候選品，編號為B。溶液配制的總體積及凍干分裝體積如Tab 1。

Tab 1 Preparation of standard solution and divide volume

具體操作：取細菌內毒精品2支，用細菌內毒素檢查用水溶解，封口膜封口后在旋渦混合器上混勻15 min，然后用刻度吸管將精品溶液吸出，放入裝有200 mL滅菌蒸餾水的1 000 mL錐形瓶中，重復2次，在磁力攪拌器上混勻30 min。分別加入內毒素檢查用水補至Tab 1中規定的體積，在4 ℃下混合攪拌2 h。然后將溶液灌裝于2 mL的安瓿中，每支裝量按Tab 1中的分裝體積制備。約2.5 h時結束，放入凍干機進行48 h凍干之后機器封口。

1.4 標準品的效價標定該標準品是用于非水溶性新型制劑的細菌內毒素檢測，在檢測中使用的方法主要為凝膠法、動態濁度法和動態顯色法。故使用以上三種內毒素檢查方法，以現行的細菌內毒素國家標準品(150800-201601)為基準，采用組織協作標定的形式，對2批候選品進行效價的標定。候選品A預估效價為每支800 EU；候選品B預估效價為每支2 500 EU。參加本次協作標定的單位共13家，標定單位名稱及各單位所使用的方法詳見Tab 2。

Tab 2 Information of laboratories participating in collaborative calibration

1.4.1標定方法要求 標定具體方法參考《中國藥典》2015年版四部附錄1143細菌內毒素檢查法。其中凝膠法標定數量為：每個協作單位提供候選品A、B各3支，共6支。要求使用2個批號的凝膠法鱟試劑，分別對6支候選品進行效價標定。其中動態濁度法或動態顯色法標定數量為：每個協作單位提供A、B批候選品各3支，共6支。要求使用1個批號的光度法鱟試劑，對6支候選品進行效價標定。

最終將標定結果匯總統計，在2批候選品中選擇3種方法標定結果間差異小且可信限率小的1批，作為新型制劑專用的細菌內毒素國家標準品。

1.4.2協作標定結果統計與定值 因生物測定方法所得數據的對數值方為正態分布，故生物測定方法的數據統計分析均采用其對數值進行計算。

2 結果

2.1 各單位標定結果匯總具體結果見Tab 3～8。

Tab 3 Results of Gel clot test of candidate A

Tab 4 Results of Gel clot test of candidate B

Tab 5 Results of kinetic turbidimetric assay of candidate A

Tab 6 Results of kinetic turbidimetric assay of candidate B

2.2 標定結果匯總統計分析按照細菌內毒素國家標準品的統計方法，經匯總統計、分析計算，標定結果見Tab 9,10。

為檢驗每批候選品3種方法標定的結果間差異有無顯著性，是否能夠合并計算，使用方差分析對3種標定方法的結果進行統計分析，結果見表11。

經檢驗，候選品B的3種方法的標定結果間差異均有顯著性，候選品A的3種方法的標定結果間差異無顯著性。

候選品B需使用卡方檢驗，對每種方法的權重進行校正，使用校正后的權重，對3種方法的結果進行加權平均，最終得到效價值和可信限率。候選品A可直接對3種方法的結果進行加權平均，得到效價值和可信限率。

2.3 效價定值按照細菌內毒素國家標準品統計方法計算，結果顯示，候選品A的3種方法的標定結果間差異無顯著性，可信限率最小。最終選擇候選品A為細菌內毒素國家標準品(非水溶性樣品用)，并根據國際上內毒素標準品效價取整原則，將其效價定值為每支700 EU。

Tab 12 Potency and FL/%

2.4 標準品的均一性研究細菌內毒素國家標準品(非水溶性樣品用)的使用方法為整支復溶后一次性使用。故符合瓶內均勻性較好的前提，可以使用簡化法均勻性方差分析。方案為抽取12支樣品，使用動態濁度法對其中11瓶測量一次計算，計算其方差作為其組間方差S1；其余1支樣品重復測量4次，計算其方差作為組內偏差S2。每次測量均為2個平行孔。詳見Tab 13。

Tab 13 Uniformity test results

2.5 非水溶性樣品檢測試驗大豆油(供注射用)在建立細菌內毒素檢查方法時，需要將細菌內毒素預先添加到大豆油中，通過回收試驗檢測出已知添加量的細菌內毒素，回收率結果應在50%～200%之間，而其他細菌內毒素國家標準品只能用水來復溶，復溶后添加到大豆油中會產生分層。若直接用大豆油溶解其他內毒素國家標準品則會出現渾濁，影響進一步實驗。

使用本標準品進行試驗，用0.5 mL大豆油溶解標準品，混勻時間不少于15 min，再進行稀釋或者萃取等步驟，如采用加入等體積細菌內毒素檢查用水，萃取15 min，靜止取水相進行檢測，其回收率在50%～200%，說明該萃取方法能將內毒素提取。

3 討論

3.1 結果分析本次標定結果中，候選品B的RSD值非常高，最高達151.4%，表明支間差異很大。分析原因，是由于本標準品不能使用賦形劑造成的。在內毒素標準品制備凍干的生產過程中，賦形劑不僅起到使標準品成形的支架作用，還可以幫助內毒素在分裝前的水溶液中分散更均勻、在凍干過程中減少升華損失，以上作用均可降低標準品凍干后的支間差異。但本標準品不能使用賦形劑，對分裝、凍干工藝的要求比其他標準品高。從標定數據也可以看出，候選品A的RSD比候選品B小很多，說明其產品的支間差異較小，生產工藝的精度更好。

雖然無賦形劑的標準物質與有賦形劑標準物質比較，支間差異略大，但其可信區間在內毒素檢測的可接受范圍內(50%～200%)，不會影響到內毒素檢測的準確性。

3.2 應用性此批標準品不僅可用于新型制劑及其輔料的內毒素檢測，其他非水溶性藥品均可使用該標準物質制備供試品的陽性對照和內毒素的檢測。故命名其為“細菌內毒素國家標準品(非水溶性樣品用)”。為了避免與現有細菌內毒素國家標準品出現結果沖突，該標準品作為現有國家標準品在特殊情況無法使用時的補充。

以膽固醇(供注射用)為例：膽固醇在建立細菌內毒素檢查方法時，無法將內毒素標準品直接添加到膽固醇中，需要用乙醇溶解膽固醇，用水溶解內毒素標準品，需要預先摸索合適的微量高濃度內毒素添加到膽固醇的乙醇溶液中，否則膽固醇或者乳糖會析出體系。使用本標準品進行試驗，用膽固醇乙醇溶液直接溶解標準品，則直接完成了供試品陽性對照。