五味子提取物對抑郁癥大鼠海馬神經元損傷的修復作用及其機制

劉美華，王素榮，劉平，郝正燕

（1.菏澤醫學專科學校附屬醫院老年醫學科，山東菏澤 274000；2.菏澤醫學專科學校附屬醫院藥學科，山東菏澤 274000）

抑郁癥是一種精神障礙性疾病，臨床表現為情緒消沉、思維遲鈍、語言行動減少等，快感缺乏、動力低下是其主要癥狀。隨著生活節奏加快，競爭壓力加大，抑郁癥患病率迅速升高[1]。目前，臨床上常用的抗抑郁癥西藥類，雖具有一定的改善效果，但同時存在耐藥性及伴有多種不良反應等問題[2]。而五味子為補虛固本中藥，具有收斂固澀、益氣生津、寧心安神的功效，作為保健食品的原料被廣泛應用于心悸失眠、津少口渴、體虛多汗等癥的治療[3]。有研究[4-6]表明，五味子及其提取物有鎮靜、催眠和抗焦慮作用。但有關五味子及其提取物更確切的抗抑郁作用機制仍不甚清楚。janus蛋白酪氨酸激酶（JAK）/信號傳導及轉錄活化因子（STAT）信號通路參與多種細胞因子的信號轉導活動，可調節神經元興奮性突觸功能，是引起長期抑郁的關鍵通路[7]。因此，本研究通過建立慢性不可預測輕度應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）抑郁大鼠模型，觀察五味子提取物對抑郁癥大鼠的治療作用，并探討其可能的作用機制，為五味子藥物的開發和抑郁癥的臨床治療提供理論依據。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物50只清潔級SD雄性大鼠，7～8周齡，體質量（200±10）g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（滬）2018-0004。飼養環境：溫度（22±2）℃，相對濕度為（65±5）%，光照周期12 h/12 h。購入后適應性飼養7 d。實驗前曠場實驗、蔗糖偏好實驗結果均不存在明顯差異。

1.2 藥物、試劑與儀器五味子提取物（五味子總素≥25.0%，五味子乙素≥18.0%，五味子甲素≥6.3%，五味子酯甲+五味子醇甲+五味子醇乙≥0.7%），陜西瑞林帕尼爾生物科技有限公司生產，批號：190617。羧甲基纖維素鈉（sodium carboxylmethyl cellulose，CMC-Na）（西安鴻朗生物科技有限公司）；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的d UTP缺口末端標記（TUNEL）試劑盒（北京中杉試劑公司）；兔抗大鼠JAK1單克隆抗體、磷酸化JAK1（p-JAK1）單克隆抗體、STAT3單克隆抗體、磷酸化STAT3（p-STAT3）單克隆抗體（美國Abcam公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（美國Abcam公司）。Lightcycler480 PCR儀（瑞士羅氏公司）；微型電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 造模與分組隨機取40只大鼠單籠孤養，參照文獻方法[8]并加以改進，建立CUMS抑郁大鼠模型。方法：大鼠接受不同應激刺激，包括4℃冰水游泳5 min、禁食禁水24 h、45℃熱應激5 min、夾尾1 min、晝夜顛倒、濕墊料24 h、噪音1 h（1 500 Hz，92 dB）、搖晃（1次/s，15 min）等，每日接受1～2種，同種刺激不能連續2次出現，使大鼠不能預料刺激的發生，連續刺激21 d。若大鼠出現飲水減少、體質量減輕、毛色晦暗、探索行為減少等癥狀，則提示建模成功[9]。將造模成功的大鼠隨機分為模型組，五味子提取物低、中、高劑量組，每組各10只。剩余10只大鼠按單籠2只混養，作為正常組，正常飼養，不給任何刺激。

1.4 給藥方法從造模第1天開始，按照動物與人體間的等效劑量換算[10]并參照以往文獻研究[11]用量，五味子提取物低、中、高劑量組分別以100、200、400 mg·kg-1·d-1劑量灌胃五味子提取物（溶解于0.5%CMC-Na），正常組和模型組灌胃等體積0.5%CMC-Na，每日1次，連續21 d。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 曠場實驗 造模結束2 h后，參照文獻研究[12]將各組大鼠逐個置于曠場箱內，曠場箱大小為80 cm×80 cm×40 cm，箱底由25塊16 cm×16 cm的正方形組成，內壁和箱底均涂為黑色，上方安裝攝像頭，實驗前將大鼠置于曠場箱內適應10 min。實驗開始后將大鼠置于曠場箱內，觀察其活動情況并錄像，每只大鼠記錄5 min水平活動和垂直活動情況。水平活動得分以大鼠穿越箱底正方形塊數計，跨一格計1分；垂直活動得分以大鼠前爪離地、后爪直立次數計，每次計1分。上只大鼠測試完畢后將糞便清理干凈，用酒精清潔箱底后再測試下只大鼠。實驗結束后，根據錄像回放，記錄每組大鼠活動得分。

1.5.2 蔗糖偏好實驗 造模結束24 h后，每只大鼠孤籠飼養。根據文獻研究[13]方法，實驗前72 h訓練大鼠適應含糖飲水，給予大鼠飲用質量分數為1%的蔗糖水。第1個24 h每籠放置2瓶質量分數為1%的蔗糖水，第2個24 h每籠放置1瓶質量分數為1%的蔗糖水和1瓶純凈水，2個水瓶外觀相同，水瓶位置隨機擺放，第3個24 h禁食禁水。之后每只大鼠同時給予1瓶質量分數為1%的蔗糖水和1瓶純凈水，放置前稱質量定量，12 h后記錄大鼠純凈水和蔗糖水消耗量。1%蔗糖水消耗率（%）=1%蔗糖水消耗量/1%蔗糖水消耗量+純凈水消耗量。

1.5.3 尼氏染色法 糖水消耗實驗結束后，取右側海馬組織固定，進行低溫冰凍切片，二甲苯脫脂，逆行濃度梯度乙醇脫脂，用蒸餾水沖洗2 min，尼氏染色液染色5 min，蒸餾水沖洗2 min，95%乙醇沖洗，梯度濃度乙醇脫水，二甲苯溶液透明，中性助教封片后，顯微鏡下觀察海馬神經元形態變化。

1.5.4 TUNEL染色法 海馬組織切片后按照TUNEL試劑盒說明書進行染色：切片脫蠟，水化；蛋白酶K室溫處理20 min；PBS漂洗3次后滴加TUNEL反應液，暗盒37℃反應1 h；PBS漂洗3次后滴加轉化劑POD，37℃反應30 min；PBS漂洗3次，滴加DAB底物溶液，25℃反應10 min，PBS漂洗3次，常規封片鏡檢。每只大鼠選擇3張海馬CA3區切片，每張選擇5個視野進行鏡檢，計算神經元凋亡百分率。神經元凋亡率（%）=凋亡神經元數/神經元總數×100%。

1.5.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法 取左側海馬組織80 mg，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液，研磨后冰上裂解30 min，離心取上清；加熱變性10 min，冷卻后用二喹啉甲酸（BCA）法測蛋白濃度；配制凝膠，樣品加入上樣緩沖液混勻，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），30 min后將蛋白冰上轉至硝酸纖維素膜；轉膜后TBST溶液漂洗10 min×3次，置于搖床室溫封閉2 h；將膜分別放入JAK1（1∶1 000稀釋）、p-JAK1（1∶1 000稀釋）、STAT3（1∶1 000稀釋）、p-STAT3（1∶1 000稀釋）等一抗稀釋液中搖床4℃孵育過夜；TBST溶液漂洗10 min×3次，將膜放入二抗稀釋液（1∶2 000稀釋）搖床室溫孵育1 h；TBST溶液漂洗10 min×3次，加入電化學發光液（ECL），暗室顯影、定影、掃描。目的蛋白相對表達量以目的蛋白條帶灰度/內參β-actin條帶灰度表示。

1.6 統計方法采用SPSS 25.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，進一步兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠水平運動和垂直運動得分比較與正常組比較，模型組水平運動得分、垂直運動得分均降低（P＜0.05）；與模型組比較，五味子提取物低、中、高劑量組水平運動得分、垂直運動得分均升高（P＜0.05）；與五味子提取物低劑量組比較，五味子提取物中、高劑量組水平運動得分、垂直運動得分均升高，五味子提取物高劑量組水平運動得分、垂直運動得分高于中劑量組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結果見表1。

2.2 各組大鼠1%蔗糖水消耗率比較正常組、模型組、五味子提取物低劑量組、五味子提取物中劑量組、五味子提取物高劑量組1%蔗糖水消耗率分別為（83.16±8.54）%、（52.67±6.01）%、（61.54±6.51）%、（68.26±7.53）%、（75.49±7.37）%。與正常組比較，模型組1%蔗糖水消耗率降低（P＜0.05）；與模型組比較，五味子提取物低、中、高劑量組1%蔗糖水消耗率均升高（P＜0.05）；與五味子提取物低劑量組比較，五味子提取物中、高劑量組1%蔗糖水消耗率均升高（P＜0.05），且五味子提取物高劑量組1%蔗糖水消耗率高于中劑量組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠水平運動和垂直運動得分比較Table 1 Comparison of horizontalmovement and verticalmovement scores between various groups of rats（±s，分）

表1 各組大鼠水平運動和垂直運動得分比較Table 1 Comparison of horizontalmovement and verticalmovement scores between various groups of rats（±s，分）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與五味子提取物低劑量組比較；④P＜0.05，與五味子提取物中劑量組比較

組別正常組模型組五味子提取物低劑量組五味子提取物中劑量組五味子提取物高劑量組F值P值鼠數/只10 10 10 10 10水平運動35.10±3.78 8.50±0.97①15.20±1.87②21.30±2.48②③27.60±2.82②③④164.067＜0.001垂直運動13.30±1.34 5.20±0.67①7.50±0.81②9.40±1.02②③11.70±1.31②③④92.247＜0.001

2.3 各組大鼠海馬神經元形態變化比較正常組大鼠海馬CA3區神經元排列整齊，形態正常，未見明顯壞死；模型組海馬CA3區神經元萎縮、排列紊亂稀疏，壞死神經元較多；五味子提取物各劑量組海馬CA3區神經元形態較規則，壞死神經元較少，均較模型組有不同程度恢復。結果見圖1。

2.4 各組大鼠海馬神經元凋亡率比較正常組、模型組、五味子提取物低劑量組、五味子提取物中劑量組、五味子提取物高劑量組海馬神經元凋亡率分別為（5.15±1.34）%、（43.68±3.47）%、（25.26±3.19）%、（15.21±2.77）%、（10.33±2.13）%。與正常組比較，模型組海馬神經元凋亡率均升高（P＜0.05）；與模型組比較，五味子提取物低、中、高劑量組海馬神經元凋亡率均降低（P＜0.05）；與五味子提取物低劑量組比較，五味子提取物中、高劑量組海馬神經元凋亡率均降低（P＜0.05），五味子提取物高劑量組海馬神經元凋亡率低于中劑量組（P＜0.05）。結果見圖2。

圖1 各組大鼠海馬神經元形態變化比較（尼氏染色，×200）Figure 1 Comparison of morphologicalchanges of hippocampalneurons between various groups of rats（by Nissl’s staining，×200）

圖2 各組大鼠海馬CA3區神經元凋亡情況比較（TUNEL法，×200）Figure 2 Comparison of hippocampal CA3 neuronal apoptosis between various groups of rats（by TUNEL method，×200）

2.5 各組大鼠海馬組織JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3蛋白表達比較海馬組織p-JAK1、p-STAT3蛋白相對表達量組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與正常組比較，模型組及五味子提取物低、中、高劑量組p-JAK1、p-STAT3蛋白相對表達量均降低（P＜0.05）；與模型組比較，五味子提取物低、中、高劑量組p-JAK1、p-STAT3蛋白相對表達量均升高（P＜0.05）；與五味子提取物低劑量組比較，五味子提取物中、高劑量組p-JAK1、p-STAT3蛋白相對表達量均升高，五味子提取物高劑量組p-JAK1、p-STAT3蛋白相對表達量高于五味子提取物中劑量組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。海馬組織JAK1、STAT3蛋白相對表達量組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表2、圖3。

3 討論

抑郁癥是一種心理障礙，表現為持續性的情緒低落，常伴有思維和行為的改變，病程遷延，多數患者有反復發作的傾向。而西藥治療抑郁癥往往有一定的局限性，因此，深入研究抑郁癥及其發病機制，尋找更可靠有效的治療藥物，提高患者的生活及生存質量，具有重要的實際意義。中藥根據辨證施治治療抑郁癥有較好的療效，且五味子鎮靜催眠、改善認知作用已被證實[4-6，14-15]。許方敏等[16]研究顯示，使用五味子醇甲干預抑郁癥小鼠，抑郁行為較正常組顯著減輕。Yan等[17]研究發現，五味子對大鼠不可預見性應激刺激引起的抑郁行為和睡眠剝奪引起的焦慮行為有治療作用。Li等[18]證實，五味子提取物對帕金森小鼠具有潛在的神經保護作用。

CUMS是制備抑郁動物模型的常見方法，本研究采用此法誘導大鼠抑郁癥模型，通過模擬抑郁癥患者日常生活中遇到的各種應激刺激，復制患者的異常行為，可以較好地評價藥物的抗抑郁作用。曠場實驗用于評定動物的自發活動與探索行為，水平運動反映大鼠的運動能力，垂直運動反映大鼠對周圍新鮮環境的好奇性。蔗糖偏好實驗用于評定動物對糖水偏好的敏感度，動物快感缺失則對糖水的偏好敏感度降低。海馬神經元損傷與抑郁癥發病機制有著密切關系。本研究結果顯示，模型組大鼠處于抑郁狀態，五味子提取物各劑量組水平運動得分、垂直運動得分、1%蔗糖水消耗率均顯著上升，海馬神經元形態較模型組有不同程度改善，海馬神經元細胞凋亡率顯著下降，提示五味子提取物有修復海馬神經元損傷并抗抑郁的作用。

表2 各組大鼠海馬組織JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3蛋白表達比較Table 2 Comparison of protein expression of JAK1，p-JAK1，STAT3 and p-STAT3 in hippocampal tissues between various groups of rats（±s）

表2 各組大鼠海馬組織JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3蛋白表達比較Table 2 Comparison of protein expression of JAK1，p-JAK1，STAT3 and p-STAT3 in hippocampal tissues between various groups of rats（±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與五味子提取物低劑量組比較；④P＜0.05，與五味子提取物中劑量組比較

組別正常組模型組五味子提取物低劑量組五味子提取物中劑量組五味子提取物高劑量組F值P值鼠數/只10 10 10 10 10 JAK1相對表達量0.95±0.12 0.97±0.11 0.89±0.09 0.92±0.10 0.95±0.11 0.864 0.493 p-JAK1相對表達量0.85±0.09 0.38±0.04①0.53±0.07②0.62±0.07②③0.73±0.08②③④63.069＜0.001 STAT3相對表達量1.12±0.13 1.06±0.11 1.08±0.12 1.04±0.11 1.09±0.13 0.635 0.640 p-STAT3相對表達量1.03±0.11 0.52±0.06①0.61±0.07②0.73±0.09②③0.85±0.09②③④54.783＜0.001

圖3 各組大鼠海馬組織JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3蛋白Western Blot電泳條帶灰度比較Figure 3 Comparison of the gray level of JAK1，p-JAK1，STAT3 and p-STAT3 proteins in hippocampaltissues between various groups of rats by Western Blot electrophoresis

JAK/STAT信號通路廣泛存在于各種組織中，參與多種細胞因子的信號轉導活動。JAKs屬于非受體型酪氨酸蛋白激酶，STATs是JAKs的下游底物，STATs通過與磷酸化JAKs偶聯活化，完成細胞外信號轉導并啟動核內基因轉錄，發揮生物學效應[19]。JAK1/STAT3是JAK/STAT信號通路中的一條重要途徑，與神經元凋亡關系密切。細胞因子作用于JAK1，導致JAK1活化，激活下游STAT3，p-STAT3進入細胞核結合靶基因，可活化下游基因表達，調控神經元的增殖與凋亡[20]。既往研究顯示，激活JAK1/STAT3通路可減少小鼠小膠質細胞和PC12神經細胞凋亡[21-22]。本研究結果顯示，五味子提取物各劑量組p-JAK1、p-STAT3蛋白表達量較模型組顯著升高，提示五味子提取物可能通過激活JAK1/STAT3信號通路發揮對海馬神經元的保護作用。

綜上所述，五味子提取物的抗抑郁作用機制，可能與激活JAK1/STAT3信號通路進而抗神經元凋亡有關。