微生物法測定功能性飲料中維生素B12含量研究

晏 濤， 劉 萍， 酈 娟， 陳 瓊， 陳 哲， 鄭 楠， 曾慧君*

(1.武漢食品化妝品檢驗所, 武漢 430040；2.國家市場監管重點實驗室(食用油質量與安全), 武漢 430040；3.武漢職業技術學院, 武漢 430072)

維生素B12作為一種常見的食品添加劑，主要用于保健食品、谷物、飲料、乳品及孕嬰食品的營養強化劑[1-3].隨著現代生活水平的提高和全民保健意識的加強，人們更多地希望從日常飲食中補充所需的營養元素，因此許多種類的功能性維生素飲料應運而生.

維生素B12的檢測至今是國際食品分析的難題之一，主要是由于維生素B12的結構形式多樣，至少有5種相似結構包括氰鈷胺、甲鈷胺、腺苷鈷胺、羥鈷胺等，且不同鈷胺素對維生素B12的缺陷菌——ATCC 7830敏感性不同[4-6].化學發光法檢測維生素B12存在檢測限低，容易受到基質中金屬離子干擾等問題[7-8].液相色譜法測定維生素B12存在靈敏度相對較差、特異性不高，對于復雜基質中維生素B12的測定存在很多困難等缺陷[9-10].因此美國分析化學家協會(AOAC)標準和中國食品安全國家標準GB 5413.14—2010都將微生物法作為檢測維生素B12的首選方法和仲裁法[11-13].

目前許多市售功能性飲料企業標準中維生素B12的檢測方法均指向GB 5413.14—2010(以下簡稱國標法)，而國標法中明確規定該標準的檢測方法只適用于嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定[14].本研究旨在建立一種快速準確測定功能性飲料中維生素B12含量的方法，從而確保市售功能性飲料添加量符合食品安全標準相關要求，避免消費者因為飲用不合格飲料可能引起的身體損傷.

本研究以功能性飲料為研究對象，參考國標法，對樣品前處理進行了優化改良，極大縮減了檢驗時間，并準確測定出功能性飲料中維生素B12的含量.本研究為功能性飲料中維生素B12的準確測定提供方法依據，為監管部門對功能性飲料中B12的監測提供技術支撐.

1材料與方法

1.1材料、菌種與試劑

材料：5種不同標示值市售功能性維生素飲料均購于武漢市內零售超市，為避免廣告嫌疑，編號1～5，詳細信息見表1.

表1 樣品信息Tab.1 Sample information

菌種：萊士曼氏乳酸桿菌(Lactobacillusleichmannii)ATCC 7830(中國工業微生物菌種保藏管理中心).

試劑：乳酸桿菌瓊脂培養基、乳酸桿菌肉湯培養基和維生素B12測定用培養基(美國 BD 公司)；維生素B12標準品(99.2%，美國Sigma-aldrich公司)；無水磷酸氫二鈉、無水偏重亞硫酸鈉、一水合檸檬酸(分析純，廣州化學試劑廠).

1.2儀器和設備

測定過程中用到的儀器設備如下：電子天平(ME204/02，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司)；恒溫培養箱(LBI-300，上海龍躍儀器設備有限公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(SX-700，日本TOMY數字生物有限公司)；渦旋振蕩器(vortex-genie2，美國SI儀器公司)；離心機(H1850R，湖南湘儀儀器有限公司)；紫外可見光分光光度計(UV-2700，島津公司)；超凈工作臺(BSC-1600ⅡA2，蘇州安泰空氣技術有限公司)；酶標儀(iMark，美國BIO RAD公司).

1.3實驗方法

1.3.1樣品稱(量)取、處理和稀釋 第一組(國標處理組)，取適量試樣，轉入250 mL錐形瓶中，加入10 mL緩沖液(每100 mL含無水磷酸氫二鈉1.3 g、無水偏重亞硫酸鈉1.0 g、一水合檸檬酸1.2 g)，加入少量水，121 ℃水解10 min，冷卻.用鹽酸(0.1 mol·L-1)調pH至4.5±0.2，轉入250 mL容量瓶中用水定容.過濾，吸取適當體積上述液體，加入適量水，用氫氧化鈉(0.1 mol·L-1)調節pH至6.8±0.2，轉入100 mL容量瓶用水定容至刻度(使稀釋液中維生素B12濃度在0.01 ng·mL-1～0.02 ng·mL-1范圍內).第二組(改良國標處理組)，取適量試樣，加入10 mL緩沖液，充分混勻加熱煮沸10 min后調節pH至6.8±0.2，轉入100 mL容量瓶定容至刻度.每種飲料做6次重復性實驗以保證結果的準確性.

1.3.2實驗用菌懸液的制備 將凍干保存的萊士曼氏乳桿菌轉接至乳酸桿菌瓊脂培養基上，37 ℃培養20～24 h，連續傳種2～3次以活化菌株.將活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養基中，37 ℃培養20～24 h，離心棄上清用生理鹽水稀釋反復洗滌3次以去掉乳酸桿菌培養基，然后用紫外分光光度計調節菌液濃度.使其透光率在70%左右.

1.3.3維生素B12標準溶液的制備 精確稱取10.0 mg維生素B12標準品，加25%乙醇溶液溶解并轉移至1 000 mL容量瓶中，用25%乙醇溶液定容至刻度即為維生素B12標準儲備液.準確吸取上述溶液5.0 mL維生素B12標準儲備溶液置于500 mL容量瓶中，用25%乙醇溶液定容至刻度即為維生素B12標準中間液.準確吸取5.0 mL維生素B12標準中間液置于500 mL容量瓶中，用25%乙醇溶液定容至刻度即為維生素B12標準工作液.臨用前分別吸取兩個5.0 mL維生素B12標準工作溶液到250 mL和500 mL容量瓶中，用水定容至刻度備用.

按表2制作標準曲線， 為保證標準曲線的線性關系，每根標準系列管制作了3個重復.

表2 標準曲線的制作Tab.2 Preparation of the standard curve

1.3.4樣品待測液的制備 取4支試管分別加入1.00 mL、2.00 mL 、3.00 mL、4.00 mL試樣提取液，補水至5.00 mL，加入5.00 mL維生素B12測定用培養液，混勻，一式三份.

1.3.5接種培養 將所有測定管封閉，于121 ℃高壓滅菌5 min后迅速冷卻，在無菌操作條件下向每支試管滴加1.3.2中接種液50 μL，蓋好塞子置于36±1 ℃恒溫培養箱中培養19～20 h，直到達到最大渾濁度，其中S1管不加菌液做空白對照.

1.3.6吸光度測定 在550 nm處，使用紫外可見光分光光度計UV-2700以未接種的S1對照管調節吸光度值為0，讀出S2管的數值.再以S2管為空白，調節吸光度為0，依次讀出其他每支試管的吸光度.

2結果與分析

2.1標準曲線分析

以標準系列管中維生素B12含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制維生素B12標準曲線.紫外分光光度計測得維生素B12標準曲線方程為：y=5.5976x+0.0357，相關系數R2為0.993 8，在0～0.1 ng范圍內，吸光度值與維生素B12含量之間的線性關系良好.

2.2樣品檢測結果分析

2.2.1樣品前處理優化及精密度結果 根據1.3.1中測得的標準曲線和測得的樣品試管的吸光度值計算所測5種不同標示值的功能性維生素飲料中的維生素B12含量，結果如表3所示.

圖1 維生素B12標準曲線Fig.1 Standard curve of vitamin B12

表3 微生物法測得功能性飲料中維生素B12結果Tab.3 Results of vitamin B12 in functional beverage by microbiological method

由表3可知，5種功能性維生素飲料6次平行測定的標準偏差在0.2～0.5之間，RSD在1.55%～3.68%之間，說明各獨立實驗之間的檢測數據重復性較好.對比5種功能性維生素飲料的實際測定值和標簽值發現，5種功能性維生素飲料的維生素B12檢測含量均符合相關標準要求.第一組和第二組的測定結果用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，差異不顯著(p值大于0.05)，提示改良優化的樣品前處理方法即改良國標處理法，也能準確測定出功能性飲料中B12的含量，可作為微生物法的首選樣品處理方式.

2.2.2質量控制檢測結果

1) 試劑盒法檢測結果.使用德國拜發商品化試劑盒測定了5種功能性維生素飲料的維生素B12含量，結果如表4，將該結果與微生物法的測定結果用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，兩者沒有統計學差異(p值大于0.05).

表4 試劑盒法測得功能性飲料中維生素B12結果Tab.4 Results of vitamin B12 in functional beverage by kit method

2) 加標回收檢測結果.為確保微生物法測定功能性飲料中維生素B12含量的準確性和結果的有效性，對試樣3進行加標回收試驗，取1 mL試樣3進行試驗，其本底值為11.4 ng，進行三個梯度加標試驗，加標量分別為5.0、10.0、20.0 ng，使用上述改良國標處理組的方法進行試樣處理，做3次重復平行實驗，根據平均值計算回收率，回收率(%)=(實測值-本底值)/加標量×100.結果如表5，平均回收率在92%～104%，符合要求.

表5 加標回收實驗結果Tab.5 Rate of standard recovery

2.3方法比較

雖然微生物法(國標法及改良國標法)與試劑盒法在檢測功能性飲料中維生素B12的含量無顯著差異，但這三種方法有其各自特點，見表6.

表6 三種檢測方法的比較Tab.6 Comparison of three methods

試劑盒法不需要準備菌懸液，可適用于無標準菌株無法制備菌懸液的實驗室，但試劑盒法價格昂貴，且是非標方法，不利于在檢驗機構推廣.國標法一直是維生素B12檢測的指定方法，我們建立的改良國標法為功能性飲料中維生素B12含量檢測的微生物方法標準的制定提供了技術參考.

3討論

國標GB 5413.14—2010適用范圍為嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定，而諸多功能性飲料生產企業都在企業標準中將其作為維生素B12的指定檢測方法，探討國標法對功能性飲料中B12的檢測顯得尤為重要.國標法樣品前處理針對的是嬰幼兒食品和乳品，食品基底是固體物質且含有大量蛋白質，需要變性和過濾過程去除，而維生素功能性飲料是液體基底且不含蛋白質成分.基于此，本研究對國標法進行了改良優化，在樣品前處理中直接加入含有偏重亞硫酸鈉的緩沖液經加熱煮沸將功能性飲料中不穩定形式的鈷胺素轉變為穩定狀態的亞硫酸合鈷胺素[15]，冷卻后直接調pH定容進行檢測，省去了國標法中繁瑣的變性、過濾等步驟，并將樣品處理過程中的2次調節pH直接縮減為1次，操作更為便捷，將單個樣品處理時間直接由原來的2 h縮短至0.5 h.此外，與試劑盒法相比，本實驗方法檢測成本更低，試劑盒法單個樣品的成本在500元左右，本實驗方法單個樣品的檢測成本在220元左右，且試劑盒法不是主流的維生素B12檢測技術，在實際檢測過程中美國分析化學家協會和中國食品安全國家標準均將微生物法作為首先方法和仲裁法，試劑盒法為非標方法只能作為輔助檢測方法.本實驗使用微生物法準確測定出功能性飲料中維生素B12的含量，測定結果靈敏性好、準確度高，為功能性飲料中維生素B12的檢測提供了可靠方法，為相關標準制定提供技術指導.

綜上，本研究有效建立了一種基于國標改良法的功能性飲料中維生素B12含量的微生物檢測方法，且相較于國標法具有檢測步驟簡單、省時、操作便捷等優點，相較于試劑盒法具有檢測成本低廉的優勢.由于微生物法的方法優勢，已有研究組將微生物法應用于發酵食品中維生素B12的測定[16-17]，隨著實驗方法的不斷優化和創新，微生物法將被應用到更多食品中維生素B12的測定.