丙泊酚對非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟脂質(zhì)堆積、肝損傷及氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用▲

石 磊 馬玉林 方 圓 周銀芳

(陜西省安康市中心醫(yī)院1 麻醉科，2 檢驗科，安康市 725000，電子郵箱：shilei251204191@126.com)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種慢性肝病，其疾病譜包括單純性脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化和肝細胞癌[1]。高熱量飲食導(dǎo)致的脂質(zhì)堆積是誘發(fā)NAFLD的首要病因，在我國，脂肪肝的發(fā)病率以每年0.594% 的速度增長[2-3]。NAFLD的進展受到多種機制調(diào)控，如脂質(zhì)堆積、氧化應(yīng)激、炎性級聯(lián)反應(yīng)等[4-6]。NAFLD的主要治療方案包括飲食控制、體重控制、運動和藥物控制，但效果不明顯[7]。許多藥物(如他汀類、貝特類)常伴有不良反應(yīng)的發(fā)生[8]。因此，亟待尋找療效確切、無副作用的治療NAFLD的藥物。丙泊酚是臨床上廣泛使用的靜脈全麻藥物，具有可迅速喚醒的優(yōu)點，可連續(xù)輸注且在體內(nèi)無積累[9]。研究表明，丙泊酚對腎臟和肝臟等器官具有積極的保護作用，可保護肝缺血/再灌注損傷[10-12]。但是目前關(guān)于丙泊酚在NAFLD治療中的作用的研究仍較少。本研究采用高脂高糖飲食建立大鼠NAFLD模型，探討丙泊酚對NAFLD大鼠模型肝損傷及氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 丙泊酚(批號：PHR1663)購自美國Sigma公司；HE染液(批號：G1120)、油紅O(批號：G1260)染液購自北京索萊寶公司；脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)試劑盒(批號：QIA39)購自美國Sigma公司；RIPA裂解液(批號：P0013B)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0012)購自碧云天生物公司；B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因(批號：ab196495)抗體、抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)(批號：ab32503)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-coA carboxylase，ACC)(批號：ab45174)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔單克隆IgG二抗、β-肌動蛋白(β-actin，批號：ab6728)均購自英國Abcam公司；抗肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1，CPT-1)(批號：orb308786)抗體購自英國Biorbyt公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(批號：A001-1-2)、丙二醛(批號：A003-1-2) 和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)(批號：A020-1-2)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。3100型全自動生化分析儀購自日本日立公司；Multiskan MK3型酶標儀購自中國賽默飛世爾公司；Mini Protean 3 Cell型電泳儀、CFX Connect96型熒光定量PCR儀均購自美國Bio-Rad公司；Tanon 5200型全自動化學(xué)發(fā)光分析儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 實驗動物 40只SPF級健康SD雄性大鼠，3周齡，體重(60±10)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號為SYXK(京)2019-0022。將大鼠置于恒定溫度(23±2)℃的室內(nèi)，保持12 h/12 h的明暗循環(huán)，并自由飲水和進食。

1.3 NAFLD大鼠模型的建立及實驗分組 參考文獻[13]，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將40只大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、丙泊酚低劑量組、丙泊酚中劑量組、丙泊酚高劑量組，每組8只。對照組大鼠喂食標準大鼠食物，即每千克食物包含48%玉米、20%大豆粉、10%麥麩、10%面粉、8%魚粉、2%粉煤灰、1%植物油、0.5%鹽和0.5%微量元素，按照1.5 mg/(kg·d)喂食，直至實驗結(jié)束。模型組與丙泊酚處理組大鼠喂食高脂高糖食物，每千克食物中包含72%標準大鼠食物、20%豬油、2%膽固醇、5%蛋黃粉、1%膽汁鹽，按照1.5 mg/(kg·d)喂食；喂養(yǎng)6周后，丙泊酚低劑量組、丙泊酚中劑量組、丙泊酚高劑量組大鼠分別加入25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg丙泊酚繼續(xù)喂食4周，每天1次，模型組繼續(xù)喂食高脂高糖食物，直至實驗結(jié)束。大鼠毛色暗淡無光澤、精神萎靡、飲食量較多和體重增加且血脂異常，表明NAFLD大鼠模型建立成功，建模成功率為81.25%。

1.4 樣品采集 丙泊酚處理4周后，將所有大鼠禁食過夜后麻醉，采取大鼠眼眶神經(jīng)叢血液，約1 mL/只，經(jīng)3 500 r/min低溫離心5 min后，吸取上層血清，儲存于-80℃環(huán)境中待檢。對動物實施安樂死并切除肝臟，稱量大鼠肝臟重量，計算肝指數(shù)，肝指數(shù)=(肝臟重量/大鼠體重)×100%，然后將一部分肝臟置于-80℃下進行蛋白免疫印跡試驗，另一部分置于4%多聚甲醛中進行組織學(xué)分析。

1.5 全自動生化分析儀測量大鼠血清脂質(zhì)代謝指標水平 采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中LDL、三酰甘油、總膽固醇和HDL水平。

1.6 HE染色觀察肝臟組織病理學(xué)變化 采用4%多聚甲醛溶液固定肝臟組織24 h以上，將肝臟組織置于脫水機內(nèi)，用濃度由低到高的乙醇依次進行梯度脫水后，于包埋機內(nèi)進行包埋，隨后于石蠟切片機上進行切片，片厚4 μm。然后將切片依次用二甲苯和乙醇進行脫蠟處理，蘇木素染色10 min，1%的鹽酸乙醇分化，洗凈后0.6%氨水返藍，流水沖洗，伊紅染色2 min后，將切片依次用乙醇和二甲苯處理至脫水透明，用中性樹膠封片，通過光學(xué)顯微鏡觀察肝臟組織病理學(xué)變化。

1.7 TUNEL染色檢測肝細胞凋亡情況 石蠟組織切片制備同1.6，取石蠟切片用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)清洗3次，每次5 min，然后與含有末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶和生物素化脫氧尿苷三磷酸的TUNEL反應(yīng)混合物于37℃下孵育1 h，PBS清洗3次，每次5 min，在37℃的洗滌緩沖液中孵育30 min終止反應(yīng)。在光學(xué)顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)TUNEL陽性細胞(棕色)的數(shù)量。細胞凋亡率=(TUNEL陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

1.8 蛋白免疫印跡試驗 用RIPA裂解緩沖液在4℃下提取各組大鼠肝組織蛋白質(zhì)，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠對等量蛋白質(zhì)(30 μg)進行電泳，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。用含5%脫脂牛奶的TBST封閉膜1 h后，用稀釋的一抗Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶2 000)、CPT-1(1 ∶500)和ACC(1 ∶500)4℃孵育過夜。然后，將膜與辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗(1 ∶3 000)于37℃下孵育1 h，并使用增強化學(xué)發(fā)光試劑ECL顯示條帶，用ImageJ定量蛋白灰度值。蛋白相對表達量以目的蛋白與β-actin灰度值的比值表示。

1.9 氧化應(yīng)激指標水平檢測 按照試劑盒說明書，分別采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)、硫代巴比妥酸法和比色法檢測1.4保存的大鼠血清中的SOD、丙二醛和LDH的含量。

1.10 油紅O染色觀察肝細胞脂質(zhì)分解情況 石蠟組織切片制備同1.6，取石蠟切片用PBS清洗3次，每次5 min，用油紅O工作液浸泡切片10 min，PBS清洗3次，每次5 min，再用油紅O染液染色15 min，75%乙醇分化2 s， 37℃蒸餾水洗15 s，然后用蘇木素染色，1%的鹽酸乙醇分化，洗凈后0.6%氨水返藍，流水沖洗，用中性樹脂封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀測大鼠肝細胞脂質(zhì)分解情況。脂肪被染成鮮紅色，細胞核染成深藍色。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝重量和肝指數(shù)的比較 模型組大鼠的肝臟重量和肝指數(shù)均高于對照組(均P<0.05)；丙泊酚中、高劑量組大鼠的肝臟重量低于模型組，且丙泊酚高劑量組大鼠的肝臟重量均低于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)，而丙泊酚低劑量組大鼠的肝臟重量和肝指數(shù)與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肝臟重量和肝指數(shù)的比較(x±s)

2.2 各組大鼠血清脂質(zhì)代謝指標水平的比較 模型組大鼠的血清LDL、三酰甘油、總膽固醇水平均高于對照組，血清HDL水平低于對照組(均P<0.05)；丙泊酚中、高劑量組大鼠的血清LDL、三酰甘油、總膽固醇水平均低于模型組，血清HDL水平高于模型組，且丙泊酚高劑量組大鼠的血清LDL、三酰甘油、總膽固醇水平均低于丙泊酚中劑量組，血清HDL水平高于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)，而丙泊酚低劑量大鼠的血清LDL、三酰甘油、總膽固醇、HDL水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清脂質(zhì)代謝指標水平的比較(x±s)

2.3 各組大鼠肝臟組織病理變化及細胞凋亡率的比較 對照組大鼠的肝臟組織形態(tài)正常，模型組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、極度腫脹、脂肪空泡大，細胞脂肪變性或壞死增加；與模型組相比，丙泊酚處理組大鼠的肝臟組織病變程度呈劑量依賴性減輕，肝小葉排列逐漸整齊，脂肪空泡變小，細胞脂肪變性減少，見圖1。模型組大鼠的肝臟組織細胞凋亡率及Bax與Bcl-2相對表達量的比值(Bax/Bcl-2)均高于對照組(均P<0.05)；丙泊酚中、高劑量組大鼠的肝臟組織細胞凋亡率及Bax/Bcl-2均低于模型組，且丙泊酚高劑量組大鼠的肝臟組織細胞凋亡率及Bax/Bcl-2均低于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)；而丙泊酚低劑量大鼠的肝臟組織細胞凋亡率與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但肝臟組織Bax/Bcl-2低于模型組(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 各組大鼠肝臟組織細胞凋亡率及Bax與Bcl-2相對表達量比值的比較(x±s)

圖1 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化及肝細胞凋亡情況[HE染色(×400)、TUNEL染色(×400)]

圖2 各組大鼠Bcl-2和Bax蛋白表達情況

2.4 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標水平的比較 模型組大鼠的血清丙二醛、LDH水平均高于對照組，血清SOD水平低于對照組(均P<0.05)；丙泊酚中、高劑量組大鼠的血清丙二醛、LDH水平均低于模型組，血清SOD水平高于模型組，且丙泊酚高劑量組大鼠的血清丙二醛、LDH水平均低于丙泊酚中劑量組，血清SOD水平高于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)，而丙泊酚低劑量組大鼠血清丙二醛、LDH、SOD水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標水平的比較(x±s)

2.5 各組大鼠肝細胞脂質(zhì)分解情況及ACC、CPT-1相對表達量的比較 對照組大鼠肝臟組織中的小脂質(zhì)滴散布在少量肝細胞中，模型組大鼠肝細胞充滿了大小不同的紅色脂滴，融合成片，看不清細胞結(jié)構(gòu)；與模型組相比，隨著丙泊酚劑量的增加，大鼠肝細胞中脂質(zhì)滴明顯變小、減少，見圖3。模型組大鼠的肝臟組織CPT-1相對表達量低于對照組，ACC相對表達量高于對照組(均P<0.05)；丙泊酚中、高劑量組大鼠的肝臟組織CPT-1相對表達量均高于模型組，且丙泊酚高劑量組大鼠的肝臟組織CPT-1相對表達量高于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)；丙泊酚低、中、高劑量組大鼠的肝臟組織ACC相對表達量均低于模型組，且丙泊酚高劑量組大鼠肝臟組織的ACC相對表達水平低于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)，見表5，圖4。

表5 各組大鼠肝臟組織ACC、CPT-1相對表達量的比較(x±s)

圖3 大鼠肝臟脂肪細胞油紅O染色(×400)

圖4 各組大鼠ACCHE CPT-1蛋白表達的情況

3 討 論

高熱量食物的攝入會導(dǎo)致脂質(zhì)堆積、炎性細胞因子過度產(chǎn)生和巨噬細胞浸潤，從而促進肝病的進展[14]。因此，高脂、富含膽固醇的飲食通常用于高脂血癥和NAFLD的實驗誘導(dǎo)。研究表明，給大鼠喂食高脂飼料可引起大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝異常和肝臟損傷等NAFLD疾病特征[15]。本研究通過高脂高糖飲食誘導(dǎo)建立NAFLD大鼠模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠的肝臟重量和肝指數(shù)均較對照組明顯升高(均P<0.05)，表明模型組大鼠已存在脂肪肝；丙泊酚中、高劑量組大鼠的肝臟重量和肝指數(shù)均低于模型組，且丙泊酚高劑量組肝臟重量低于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)，而丙泊酚低劑量組大鼠的肝臟重量和肝指數(shù)與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，提示給予高劑量(100 mg/kg)的丙泊酚干預(yù)能夠有效地減輕NAFLD大鼠的肥胖體征。

“兩次打擊”理論是目前大多數(shù)學(xué)者認可的影響NAFLD進展的作用機制，即第一次打擊是肝細胞中脂質(zhì)的堆積，第二次打擊是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的脂毒性，其促進了NASH的細胞損傷[16-17]。HDL主要由肝臟合成，因其體積小而能夠自由進出動脈管壁并攝取沉浸在血管壁內(nèi)膜底層的LDL、三酰甘油、總膽固醇等有害物質(zhì)，然后將這些有害物質(zhì)轉(zhuǎn)運到肝臟進行代謝清除[18]。總膽固醇、三酰甘油和LDL水平升高以及HDL水平降低是高脂血癥的主要癥狀，而血脂異常是NAFLD的主要危險因素，血清三酰甘油、總膽固醇、LDL和HDL水平能夠反映NAFLD的病變程度[19]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的血清LDL、三酰甘油、總膽固醇水平均高于對照組，血清HDL水平低于對照組(均P<0.05)，這表明模型組大鼠血脂異常、脂質(zhì)代謝紊亂；丙泊酚中、高劑量組大鼠的血清LDL、三酰甘油、總膽固醇水平均低于模型組，血清HDL水平高于模型組，且丙泊酚高劑量組大鼠的血清LDL、三酰甘油、總膽固醇水平均低于丙泊酚中劑量組，血清HDL水平高于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)，而丙泊酚低劑量組大鼠的血清LDL、三酰甘油、總膽固醇、HDL水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，這提示給予高劑量(100 mg/kg)的丙泊酚干預(yù)能降低NAFLD大鼠血清三酰甘油、總膽固醇和LDL水平，提高HDL水平，具有明顯的降脂作用。

作為NAFLD診斷的“黃金標準”，HE染色為評估藥物的抗肝脂肪變性作用提供了可靠證據(jù)。本研究HE染色結(jié)果顯示，NAFLD大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、極度腫脹、脂肪空泡大，細胞脂肪變性或壞死增加，而丙泊酚能夠有效地改善肝組織病變。研究證實，丙泊酚可通過調(diào)節(jié)Toll樣受體4/核因子κB/核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3途徑減輕炎癥反應(yīng)和細胞凋亡，從而保護D-半乳糖胺/脂多糖誘導(dǎo)的急性肝損傷[10]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的肝臟組織細胞凋亡率及Bax/Bcl-2均高于對照組(均P<0.05)；丙泊酚中、高劑量組大鼠的肝臟組織細胞凋亡率，以及丙泊酚低、中、高劑量組大鼠的肝臟組織Bax/Bcl-2均低于模型組，且丙泊酚高劑量組大鼠的肝臟組織細胞凋亡率及Bax/Bcl-2均低于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)，這提示：給予高劑量(100 mg/kg)的丙泊酚干預(yù)對NAFLD大鼠的肝損傷具有明顯的保護作用。

氧化應(yīng)激是NASH發(fā)病和病情進展的主要決定因素[20]。丙二醛是脂質(zhì)過氧化降解的主要產(chǎn)物，它會引起膜蛋白和酶反應(yīng)，增強膜通透性，改變細胞膜的結(jié)構(gòu)、功能和新陳代謝，最終對人體造成傷害[21]。SOD是一種包含金屬元素的酶，廣泛分布于各種生物中，可以消除自由基并防止體內(nèi)脂質(zhì)氧化損傷[22]。LDH是一種糖酵解酶，可以催化丙酮酸生成乳酸，是肝損傷的標志物[23]。丙泊酚含有抗氧化活性的酚羥基，可通過抑制活性氧釋放，降低H9c2細胞衰老相關(guān)基因的蛋白表達，從而具有心臟保護作用[24]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的血清丙二醛、LDH水平均高于對照組，血清SOD水平低于對照組(均P<0.05)；丙泊酚中、高劑量組大鼠的血清丙二醛、LDH水平均低于模型組，血清SOD水平高于對照組，且丙泊酚高劑量組大鼠的血清丙二醛、LDH水平均低于丙泊酚中劑量組，血清SOD水平高于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)，而丙泊酚低劑量組大鼠血清丙二醛、LDH、SOD水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，這提示丙泊酚能提高大鼠的抗氧化能力，給予高劑量(100 mg/kg)的丙泊酚可以通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)來減輕NAFLD大鼠的肝損傷。

油紅O是一種脂溶性偶氮染料，能特異性地使組織和細胞內(nèi)中性三酰甘油、脂質(zhì)以及脂蛋白等染成紅色。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肝細胞油紅O染色脂滴呈彌漫性分布，且肝細胞中分解代謝標志物CPT-1相對表達量低于對照組，合成代謝標記物ACC高于對照組，丙泊酚中、高劑量組大鼠的肝臟組織CPT-1相對表達量均高于模型組，丙泊酚低、中、高劑量組大鼠的肝臟組織ACC相對表達量均低于模型組，且丙泊酚高劑量組大鼠的肝臟組織CPT-1相對表達量高于丙泊酚中劑量組、ACC相對表達量低于丙泊酚中劑量組(均P<0.05)。這提示，丙泊酚可減少NAFLD大鼠肝細胞中的脂質(zhì)滴，并上調(diào)CPT-1及下調(diào)ACC的表達，給予高劑量(100 mg/kg)的丙泊酚干預(yù)可促進NAFLD大鼠肝細胞中脂質(zhì)的分解以阻止NAFLD進展。

綜上所述，給予高劑量(100 mg/kg)的丙泊酚干預(yù)不僅能夠降低NAFLD大鼠的肝臟重量及肝指數(shù)，調(diào)節(jié)NAFLD引起的脂質(zhì)代謝紊亂、促進脂質(zhì)分解，還可以緩解氧化應(yīng)激及細胞凋亡造成的肝損傷，阻止NAFLD的進一步發(fā)展。