基于微衛星分析的長豐鰱種質資源遺傳監測

羅相忠 覃維敏 梁宏偉 沙 航 鄒桂偉

(中國水產科學研究院長江水產研究所, 武漢 430223)

鰱(Hypophthalmichthys molitrix)是我國重要的特有經濟魚類, 具食物鏈短、易飼養、成本低、調節水質等特性和功效。其以水體中浮游植物為主要餌料, 屬濾食性魚類, 為典型的碳匯漁業養殖對象[1]。鰱的營養價值較高, 必需氨基酸含量均略高于鯉(Cyprinus carpio); 二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的含量高于鳙(Aristichthys nobilis); 一直深受廣大養殖戶和消費者所青睞。鰱在大部分池塘、湖泊和水庫中均有養殖或增殖, 是淡水養殖的當家品種之一。我國鰱養殖產量僅次于草魚(Ctenopharyngodon idellus), 位居淡水養殖種類的第二位[2]。長豐鰱(Changfeng silver carp)(CF)是中國水產科學研究院長江水產研究所選育而成的鰱新品種(證書: GS-01-001-2010), 也是我國“四大家魚”的第一個人工培育新品種, 具有生長快、遺傳純合度高、出肉率高和較耐低氧等優良特點, 其推廣應用提高了我國鰱的良種覆蓋率[3]。

長豐鰱自通過審定, 已連續繁育了3代, 即長豐鰱子一代(CF1)、長豐鰱子二代(CF2)和長豐鰱子三代(CF3)。其大多數親本均由長豐鰱良種場和繁育基地連續繁育, 就此系統開展長豐鰱種質資源遺傳監測和評估, 對其優良性狀的保持具有重要意義。微衛星(SSR)因其穩定性高、多態性豐富、共顯性遺傳、位點分布廣及分析成本低等特點被廣泛應用于水產種質資源的遺傳監測。唐首杰等[4]通過微衛星對團頭魴(Megalobrama amblycephala)3個選育群體進行的遺傳純度檢測, 為純化育種群體和監測種質質量提供了理論依據。李耀國等[5]采用微衛星對三亞海域卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)的養殖群體與野生群體進行了遺傳多態性分析, 及基因型與性狀的關聯分析, 證實野生群體遺傳多樣性較養殖群體高; 微衛星位點中存在全長、體寬、體高和體質量的優勢基因型。王豐等[6]用12個微衛星標記對長江4個野生青魚(Mylopharyngodon piceus)群體和1個養殖群體進行了遺傳多樣性和結構分析, 5個群體均具有較高遺傳多樣性, 其中4個野生群體之間遺傳距離較近, 且均與養殖群體之間遺傳距離較遠。此外, 還有對大口黑鱸(Micropterus salmoides)[7]、唇?(Hemibarbus labeo)[8]、大瀧六線魚(Hexagrammos otakii)[9]、團頭魴[10]、鯉[11]和大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[12]等選育群體遺傳監測的研究報道, 為評估相關選育群體的育種潛力和培育新品種(系)提供了支撐。本研究旨在利用微衛星標記分析長豐鰱連續不同世代群體的遺傳多樣性與遺傳結構, 為其優良性狀延續保持技術的建立與品種的持續升級換代提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

CF1親本群體采集于河南省南陽市宛城區白河橋漁場長豐鰱良種繁育基地, 共采集21尾; 而CF2、CF3和L群體采集于湖北省浠水縣長豐鰱良種場, 分別采集30尾。采集樣本置于95%的乙醇中固定,-20℃冰箱中保存備用。樣本基本信息見表 1。

表1 長豐鰱各齡體長及體質量組成Tab. 1 Body length and body mass in each age group of Changfeng silver carp

1.2 DNA提取

采用高鹽法進行樣本基因組DNA提取, 經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 用無菌雙蒸水調整濃度為50 ng/μL, -20℃保存備用。

1.3 微衛星引物

采用本團隊自主開發的18對鰱微衛星引物進行分析, 熒光引物由武漢天一輝遠生物公司合成,引物序列及退火溫度如表 2所示。

表2 鰱衛星分子標記及其引物序列Tab. 2 Microsatellite markers and their primers sequences in silver carp

1.4 PCR擴增

PCR反應體系為20 μL, 其中模板DNA 1 μL (50 ng),上下游引物各0.5 μL, PCR mix 18 μL; PCR擴增程序為: 94℃預變性3min; 94℃變性30s, 退火(44—60℃)30s, 72℃延伸30s, 30個循環; 72℃延伸5min;4℃保存。

1.5 數據處理

采用熒光引物對4個群體樣本進行擴增, 其產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行毛細管電泳;采用Popgene1.3.1軟件分析等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、期望雜合度(He)和觀測雜合度(Ho)及子代間的遺傳相似性系數、遺傳距離等遺傳參數; 利用Cervus 3.0軟件計算多態信息含量(Polymorphism information content,PIC); 近交系數(Fis)和群體間的遺傳分化指數(Fst)及哈代-溫伯格平衡由Arlequin 3.1.1分析軟件統計獲得; 群體間聚類分析圖采用MEGA 5.0軟件中UPGMA方法構建。

2 結果

2.1 鰱與長豐鰱各子代的遺傳多樣性分析

18個鰱微衛星位點在L、CF1、CF2和CF3群體中檢測到等位基因數分別為130、103、93和91個(表 3)。L、CF1、CF2和CF3的平均等位基因數(Na)分別為7.2222、5.7222、5.1667和5.0556, 平均有效等位基因數(Ne)分別為4.3122、3.2551、3.2274和3.1461(表 3); 鰱平均等位基因數和平均有效等位基因數均比長豐鰱后代高, 其在長豐鰱后代中呈逐代下降趨勢。各微衛星位點Na和Ne見表 3, 在鰱L群體中Na和Ne最高的是位點BL5; 在長豐鰱子一代(CF1)群體中Na和Ne最高的分別是位點BL109和位點BL5; 在長豐鰱子二代(CF2)群體中Na最高的是位點BL5和位點BL109, 而Ne最高的是位點BL5; 在長豐鰱子三代(CF3)群體中Na最高的是位點BL5、BL55和BL109,Ne最高的是位點BL5。

2.2 群體的雜合度

鰱觀測雜合度為0.2667—1.0000, 平均觀測雜合度為0.7190, 期望雜合度為0.2350—0.8994, 平均期望雜合度為0.7260; 長豐鰱子一代(CF1)平均觀測雜合度為0.6975, 平均期望雜合度為0.6422; 長豐鰱子二代(CF2)平均觀測雜合度為0.6111, 平均期望雜合度為0.6353; 長豐鰱子三代(CF3)平均觀測雜合度為0.5407, 平均期望雜合度為0.6235(表 3)。4個群體中平均觀測雜合度和期望雜合度： 鰱＞長豐鰱子一代＞長豐鰱子二代＞長豐鰱子三代; 鰱雜合度較長豐鰱高, 不同群體在同一位點雜合度也有所不同, 同一位點在同一種群中觀測雜合度和期望雜合度相差較大, 如位點S92和位點H121; 可能是該位點上的無效等位基因所致; 若無效等位基因不被識別, PCR擴增時會導致純合子過剩或雜合子缺失,從而導致Ho和He出現偏差。

2.3 多態信息含量(PIC)

4個群體多態信息含量(PIC)為0.0320—0.8730(表 3), 鰱的平均多態信息含量(PIC)高于長豐鰱三個子代, 而長豐鰱各子代間平均PIC呈現逐代下降趨勢。4個群體多態信息含量由高到低依次為: 鰱(0.6748)＞長豐鰱子一代(0.5784)＞長豐鰱子二代(0.5730)＞長豐鰱子三代(0.5609); 鰱群體中PIC最高位點是BL109, 長豐鰱各子代群體中PIC最高位點都是BL5。

2.4 Hardy-Weinberg平衡分析

如表 4所示, 位點H121和BL55的d值在4個群體中均為負值, 表明4個群體在這2個基因位點上可能存在雜合子缺失。在鰱群體中有8個位點的d值為負數, 而在長豐鰱子一代、子二代和子三代中d值為負數的位點數量分別為5、11和13個。4個群體平均d值分別為0.0044、0.0681、-0.0345、-0.1178,其中鰱和長豐鰱子一代的d值為正數, 長豐鰱子二代與子三代2個群體的d值為負數。這說明后2個群體都可能存在雜合子缺失情況, 且長豐鰱子三代雜合子缺失最為嚴重。如表 3所示, 位點H121、H129和S78在4個群體中都偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(P＜0.05)。4個群體平均Hardy-Weinberg平衡P值分別為0.3096、0.4230、0.2844和0.1635,P值均大于0.05, 4個群體都處于Hardy-Weinberg平衡狀態。

表3 18個位點在鰱和長豐鰱4個群體中的遺傳多樣性Tab. 3 Genetic diversity of four populations of silver carp and Changfeng silver carp based on 18 polymorphic microsatellite loci

續表3

表4 Hardy-Weinberg平衡檢測d值及P值Tab. 4 The d and P value of each locus by Hardy-Weinberg test

2.5 固定指數

鰱與長豐鰱子一代、子二代和子三代平均近交系數Fis分別為-0.057、-0.0017和0.0372(表 5);鰱與長豐鰱后代間遺傳分化系數Fst分別為0.0319、0.0301和0.0352(表 6); 4個群體間Fst最大的是鰱與長豐鰱子三代, 為3.52%(表 6)。在長豐鰱后代中,CF1與CF2間遺傳分化指數值0.0164, CF1與CF3間遺傳分化指數值0.0286, CF2與CF3間遺傳分化指數值0.0176; 其中CF1與CF2間遺傳分化指數最小, 其遺傳變異主要是來自個體之間; 鰱與長豐鰱后代之間遺傳分化指數值(Fst)較高, 而長豐鰱各后代之間遺傳分化很低。

表5 鰱、長豐鰱各世代間Fis和Fst值比較Tab. 5 Comparison of Fis and Fst values among different generations of silver carp and Changfeng silver carp

長豐鰱子代群體有一定程度觀測雜合度過剩現象, 子一代、二代和三代群體雜合子過剩位點數分別為13、7和6個; 鰱群體中近交系數Fis最高位點是H121(0.5200; 表 7), 該位點在群體內遺傳變異程度低, 遺傳多樣性也低; 4個群體微衛星位點中BL55遺傳分化(Fst)值最大(0.0642), BL116值最小(0.0178); 平均值為0.0406; 遺傳分化程度較弱的位點有13個, 中等的位點 5個; 而在長豐鰱后代中遺傳分化(Fst)平均值為0.0282, 僅BL55遺傳分化程度中等, 其他位點都程度較弱, H121和BL56分化程度最低為0.0039(表 7); 長豐鰱后代在檢測的18個多態位點上都表現出遺傳分化不明顯, 處于低等水平。

表7 鰱、長豐鰱各世代18對微衛星位點的F-檢驗Tab. 7 F-statistics for different generations of silver carp and Changfeng silver carp at 18 microsatellite loci

2.6 遺傳距離及遺傳相似性系數

4個群體間遺傳距離為0.0299—0.0934(表 8),鰱與長豐鰱三個世代遺傳距離最遠(0.1174), 與CF2的遺傳距離為0.1115, 與CF1的遺傳距離為0.1114, 鰱與長豐鰱子一代、子二代和子三代之間遺傳距離逐漸上升; 而在長豐鰱子代之間, 子一代與子二代之間遺傳距離為0.0392, 與子三代之間遺傳距離為0.0951; 子二代和子三代遺傳距離為0.0544, 其后代遺傳距離有上升趨勢; 鰱與長豐鰱各子代之間遺傳相似性系數為0.8892—0.8946, 群體間遺傳相似度較高, 但長豐鰱后代群體間遺傳相似性系數則更高, 其中CF1與CF2之間遺傳相似度最高(0.9616), 而CF1與CF3相對較低(0.9093)。依據4個群體間遺傳距離值, 采用UPGMA法構建聚類圖(圖 1), 長豐鰱CF1群體最先與CF2匯成一支, 接著與CF3匯成一簇, 最后與鰱聚在一起。

圖1 鰱、長豐鰱共4個群體基于Nei氏無偏遺傳距離的UPGMA進化樹Fig. 1 An unweighted pair group method with arithmetic mean(UPGMA) dendrogram for 4 populations of silver carp and Changfeng silver carp based on Nei’s unbiased genetic distance

表8 鰱、長豐鰱共4個群體的Nei氏遺傳距離(下三角)及遺傳相似性系數(上三角)Tab. 8 Nei’s standard genetic distance (below) and genetic identity (above) between 4 populations of silver carp and Changfeng silver carp

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性

生物遺傳多樣性能反映一個種群的進化、演化歷程, 是物種長期適應環境和生存的基礎。遺傳多樣性的高低是衡量生物對環境適應能力的重要指標。遺傳多樣性越高, 生物對環境的適應性就越強; 生物越易存活下來, 適應新環境并繁衍后代[13]。遺傳多樣性也是衡量物種遺傳潛力的重要指標。遺傳潛力與生物遺傳多樣性多呈正相關; 潛力越大, 遺傳多樣性也越豐富。在本研究中鰱群體等位基因數和有效等位基因數均高于長豐鰱群體, 主要是因為長豐鰱由長江水系的原始親本雌性個體經雌核發育等技術選育而來。在雌核發育的草魚和團頭魴后代中也發現其平均等位基因數低于普通群體[14,15]。在長豐鰱后代中, 不同子代間等位基因數(Na)和有效等位基因數(Ne)都呈逐漸下降的趨勢。隨著人工繁育世代的增加, 群體間近交程度加重, 群體中會存在等位基因丟失現象。與此同時,也會剔除一些非目標性狀基因, 穩定目標性狀基因,達到相關基因進一步純合, 遺傳多樣性和育種潛力也降低。在長豐鰱后代中平均等位基因和有效等位基因均比葉香塵等[16]檢測的長豐鰱等位基因數要多, 可能是由于檢測樣本或檢測方法不同造成的。在通常情況下, 檢測等位基因數和研究樣本量的大小有關[17]。與傳統聚丙烯酰胺凝膠電泳相比,基因分型技術有更高的分辨率, 可分辨出2—4 bp的等位基因[18], 極大地提高檢測的準確性和檢測效率。

雜合度是評估遺傳多樣性的重要指標之一。期望雜合度是評價群體生物多樣性的最適參數, 能直接反映群體遺傳多樣性。期望雜合度He高低與生物適應性呈正相關。一個物種的期望雜合度越高, 適應環境能力越強, 生存機會亦越大[19]。在本研究中4個群體的觀測雜合度和期望雜合度均為鰱最高, 長豐鰱子三代最低。在長豐鰱3個群體中, 期望雜合度區間為0.6235—0.7260, 均高于葉香塵等[16]檢測的廣西養殖長豐鰱(0.4133), 且低于檢測的長江三峽庫區4個群體鰱(0.7500—0.7943)[20]。總體上, 在長豐鰱3個子代中, 期望雜合度呈逐漸下降趨勢, 這與大口黑鱸世代選育群體逐代下降變化趨勢一致[7]。在長豐鰱3個子代間, 期望雜合度相差不大, 從子一代到子三代減少了3.00%。觀測雜合度子三代較子一代減少了29.00%。與張天時等[21]在中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)發現的觀測雜合度下降3.5%相比, 降比更大。長豐鰱隨著繁育子代的增加, 群體純合度增加。與此同時, 長豐鰱3個子代群體期望雜合度均較高, 群體尚未出現明顯的近交及瓶頸效應, 群體遺傳多樣性保持較好, 其具備持續選育潛力。

根據Botstein等[22]對微衛星位點多態性的定義,當PIC＜0.25時, 該位點多態性低;PIC值在0.25—0.50, 表明其具有中度多態性;PIC＞0.50時,該位點多態性高。鰱及長豐鰱子一代、二代和三代4個群體平均PIC值分別為0.6748、0.5784、0.5730和0.5609, 表明4個群體遺傳多樣性都較高, 但長豐鰱群體間呈逐代下降趨勢。基于Hardy-Weinberg平衡檢驗結果, 4個群體平均d值分別為0.0044、0.0681、-0.0345和-0.1178。d值為負數, 表明長豐鰱子二代和子三代群體雜合子缺失嚴重, 在中國對蝦、南方擬?(Pseudohemiculter dispar)、斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、團頭魴和德國鏡鯉(Cyprinus carpioL.)等群體的研究中也發現類似現象[21,23—26]。雜合子缺失可能是無效等位基因存在或在聚合酶鏈式反應中出現丟失現象所引起, 但也可能與選育群體被高強度選擇有關[27]。或者是在人工繁殖時群體雌雄比例、配組繁殖不合理導致近親繁殖, 也可能因檢測樣本數太少引起。在長豐鰱后代親本培育時受人為干擾嚴重, 亦會導致雜合子缺失。平衡偏離會造成一些不利影響。如群體內等位基因丟失, 導致純合子比例上升, 種群遺傳多樣性隨之降低,近交衰退幾率也會上升, 最終可能會導致整個種群衰退。在今后應持續監測關注群體遺傳多樣性。

3.2 群體遺傳變異分析

生物對環境適應性改變是其生存和繁衍的基礎, 群體遺傳變異程度是衡量一個群體存在選育潛力和種質資源可持續利用的前提。18個鰱微衛星位點中有10個位點近交系數Fis值為正值, 8個位點為負值, 平均Fis值0.0119。3個長豐鰱子代間存在輕度的近交現象, 3個群體Fis值分別為-0.0943、0.0229和0.1029, 世代間近交程度逐漸加重。今后在人工繁殖中應盡可能擴大繁育親本群體, 制定科學合理的繁育計劃。遺傳分化指數(Fst)是衡量群體間遺傳分化程度的重要參數。McConnell S等[28]認為,Fst值在0.00—0.05, 群體間遺傳分化較小; 在0.05—0.15, 存在中等程度遺傳分化; 在0.15—0.25,群體間遺傳分化較大; 在0.25以上, 群體間遺傳分化明顯。長豐鰱后代群體中各位點Fst值在0.0039—0.0610, 群體平均遺傳分化指數為0.0282, 群體遺傳分化很小。此研究結果與李镕等[7]研究大口黑鱸世代群體總遺傳分化指數為0.013相近。這表明長豐鰱后代遺傳結構基本一致, 雖出現一定的遺傳分化,但分化程度較低。長豐鰱子一代與子二代Fst值最小為0.0164, 子二代與子三代Fst為0.0176, 子一代與子三代的遺傳分化指數Fst最大(0.0286)。隨著選育進程的不斷開展, 世代間遺傳分化系數在相鄰世代之間相繼減小, 亦可能會進一步增大[29]。長豐鰱不同世代間遺傳變異大部分來自群體內, 群體間遺傳分化程度很低。長豐鰱世代間遺傳距離均較小,說明其遺傳相似性變高。就目前而言, 雖然長豐鰱群體間遺傳多樣性逐代降低, 但遺傳多樣性水平還維持在較高水平, 長豐鰱不同世代間遺傳結構趨于穩定。